M-MLV Neoscript teskari transkriptaza
Neoscript teskari transkriptaza - teskari transkriptaza bo'lib, Moloney murin leykemiya virusi kelib chiqishi va E.coli-da ifodalanishi M-MLV genining mutatsion skriningi natijasida olingan.Ferment RNase H faolligini olib tashlaydi, yuqori haroratga chidamliligiga ega va yuqori haroratli teskari transkripsiyaga mos keladi.Shuning uchun u RNKning yuqori darajadagi tuzilishi va cDNK sinteziga xos bo'lmagan omillarning salbiy ta'sirini yo'q qilish uchun foydalidir va yuqori barqarorlik va teskari transkripsiya sintezi qobiliyatiga ega.Ferment yuqori barqarorlik va teskari transkripsiya sintezi qobiliyatiga ega.
Komponentlar
1.200 U/mL Neoscript teskari transkriptaza
2.5 × Birinchi qatorli bufer (ixtiyoriy)
* 5 × First-Strand Bufer tarkibida dNTP mavjud emas, reaktsiya tizimini tayyorlashda dNTP qo'shing.
Tavsiya etilgan ilova
1.Bir bosqichli qRT-PCR.
2.RNK virusini aniqlash.
Saqlash holati
Uzoq muddatli saqlash uchun -20 ° C, ishlatishdan oldin yaxshilab aralashtirish kerak, tez-tez muzlashdan saqlaning.
Birlik ta'rifi
Bir birlik poli(A)•oligo(dT) yordamida 37°C da 10 daqiqada 1 nmol dTTP ni o‘z ichiga oladi.25shablon/astar sifatida.
Sifat nazorati
1.SDS-PAGE elektroforetik tozaligi 98% dan yuqori.
2.Kuchaytirish sezgirligi, partiyadan partiyaga nazorat qilish, barqarorlik.
3.Ekzogen nukleaza faolligi yo'q, ekzogen endonukleaz yoki ekzonukleaz bilan ifloslanish yo'q
Birinchi zanjirli reaktsiya eritmasi uchun reaktsiyani sozlash
1.Reaksiya aralashmasini tayyorlash
| Komponentlar | Ovoz balandligi |
| Oligo(dT)12-18 Astar yoki Tasodifiy astara Yoki genga xos primerlarb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 mkl |
| Shablon RNK | Jami RNK≤ 5 mkg;mRNK≤ 1 mkg |
| RNazsiz dH2O | 10 mL gacha |
Eslatmalar:a/b: Iltimos, tajriba ehtiyojlaringizga qarab har xil turdagi primerlarni tanlang.
2.5 daqiqa davomida 65 ° C da qizdiring va muzda 2 daqiqa davomida tez soviydi.
3.Yuqoridagi tizimga quyidagi komponentlarni umumiy hajmi 20 µL qo‘shing va muloyimlik bilan aralashtiring:
| Komponentlar | Ovoz (mL) |
| 5 × Birinchi qatorli bufer | 4 |
| Neoscript teskari transkriptaza (200 U/mkl) | 1 |
| RNaz inhibitori (40 U/mkl) | 1 |
| RNazsiz dH2O | 20 mL gacha |
4.Reaksiyani quyidagi shartlarga muvofiq bajaring:
(1) Tasodifiy astar ishlatilsa, reaktsiya 10 daqiqa davomida 25 ℃ da, keyin esa 50 ℃ da 30 ~ 60 daqiqa davomida amalga oshirilishi kerak;
(2) Agar Oligo dT yoki maxsus primerlar ishlatilsa, reaktsiya 50 ℃ da 30 ~ 60 daqiqa davomida amalga oshirilishi kerak.
5.Neoscript teskari transkriptazani faolsizlantirish va reaktsiyani tugatish uchun 5 daqiqa davomida 95 ℃ da qizdiring.
6.Teskari transkripsiya mahsulotlari to'g'ridan-to'g'ri PCR reaktsiyasi va floresan miqdoriy PCR reaktsiyasida ishlatilishi yoki -20 ℃ da uzoq vaqt saqlanishi mumkin.
PCR Rharakat:
1.Reaksiya aralashmasini tayyorlash
| Komponentlar | Diqqat |
| 10 × PCR buferi (dNTP bepul, Mg²+ bepul) | 1× |
| dNTP (har bir dNTP 10 mM) | 200 mkM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNK polimeraza (5U/mkl) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 mkM) | 0,2-1 mkM |
| Primer 2 (10 mkM) | 0,2-1 mkM |
| Shablona | ≤10% Birinchi zanjir reaktsiyasi eritmasi (2 mkl) |
| ddH2O | 50 mL gacha |
Eslatmalar:a: Agar juda ko'p birinchi zanjirli reaktsiya eritmasi qo'shilsa, PCR reaktsiyasi inhibe qilinishi mumkin.
2.PCR reaktsiyasi tartibi
| Qadam | Harorat | Vaqt | Velosipedlar |
| Oldindan denaturatsiya | 95℃ | 2-5 daqiqa | 1 |
| Denaturatsiya | 95℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Yuvish | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Kengaytma | 72℃ | 10-60 sek |
Eslatmalar
1.42 ℃ ~ 55 ℃ oralig'ida teskari transkripsiya haroratini optimallashtirish uchun javob beradi.
2.U yaxshi barqarorlikka ega, yuqori haroratli teskari transkripsiyani kuchaytirish uchun javob beradi.Bundan tashqari, u RNKning murakkab strukturaviy hududlaridan samarali o'tish uchun qulaydir.Bundan tashqari, ubir bosqichli multipleks floresan miqdoriy RT-PCR aniqlash uchun javob beradi.
3.Turli xil PCR kuchaytiruvchi fermentlar bilan yaxshi muvofiqligi va yuqori sezuvchanlik RT-PCR reaktsiyalari uchun javob beradi.
4.Yuqori sezuvchanlik bir bosqichli floresan miqdoriy RT-PCR reaktsiyasi uchun javob beradi, shablonlarning past konsentratsiyasini aniqlash tezligini samarali yaxshilaydi.
5.cDNA kutubxonasini qurish uchun javob beradi.
