M-MLV teskari transkriptaza
RevScript teskari transkriptaza genetik muhandislik texnologiyasi yordamida olinadi.U yuqori cDNK sintez qobiliyatiga, termal barqarorlikka va reaksiya harorati chegarasiga (60 ° C gacha) ega.Sintezlangan cDNK mahsuloti 10 kb gacha.Shablonlarning yaqinligini oshiradi va murakkab ikkilamchi tuzilishga ega yoki kam nusxali genlarga ega bo'lgan RNK shablonlarining teskari transkripsiyasi uchun javob beradi.
Komponentlar
| Komponent | HC2003 B (10 000U) | HC2003 B (5*10 000U) | HC2003 B (200 000U) |
| RevScript teskari transkriptaza (200U/mkl) | 50 mkl | 5×50 mkl | 1 ml |
| 5 × RevScript buferi | 250 mkl | 1,25 ml | 5 ml |
Saqlash holati
Ushbu mahsulot -25 ° C ~ -15 ° C haroratda 2 yil davomida saqlanishi kerak.
Birlik ta'rifi
Bir birlik 1 nmol dTTP ni kislotada erimaydigan materialga 10 daqiqada 37 ° C da primer sifatida Oligo (dT) yordamida kiritadi.
Reaktsiyani sozlash
1.RNK shablonining denaturatsiyasi (Bu bosqich ixtiyoriy, RNK shablonining denaturatsiyasi ikkinchi darajali tuzilmalarni ochishga yordam beradi, bu cDNKning birinchi zanjirining hosildorligini oshiradi.)
| Komponentlar | Ovoz (mL) |
| RNazsiz ddH2O | 13 gacha |
| Oligo(dT)18 (50 mkmol/l) yoki tasodifiy astar (50 mkmol/L) Yoki genga xos primerlar (2 mkmol/l) | 1 |
| yoki 1 | |
| yoki 1 | |
| RNK shabloni | X a |
Eslatmalar:
1) a: Jami RNK: 1-5 ug yoki mRNK: 1-500 ng
2) 65°C da 5 daqiqa davomida inkubatsiya qiling, so‘ng darhol muzga 2 daqiqa sovutish uchun o‘tkazing.Reaksiya suyuqligini yig'ish uchun qisqa santrifugalash, quyidagi jadvalda ko'rsatilganidek, teskari transkripsiya reaktsiyasi eritmasini qo'shing.Aralashtirish uchun muloyimlik bilan pipetka bilan torting.
1.Reaksiya aralashmasini tayyorlash (20 mkl hajm)
| Komponentlar | Ovoz (mL) |
| Oldingi bosqichning aralashmasi | 13 |
| 5 × bufer | 4 |
| dNTP aralashmasi (10nmol/L) | 1 |
| Teskari transkriptaza (200 U/mkl) | 1 |
| RNaz inhibitori (40 U/mkl) | 1 |
1.Reaksiyani quyidagi sharoitlarda bajaring:
| Harorat (°C) | Vaqt |
| 25 °Ca | 5 daqiqa |
| 42 °Cb | 15-30 daqiqa |
| 85 °Cc | 5 daqiqa |
Eslatmalar:
1) a.25°C da 5 daqiqa davomida inkubatsiya qilish faqat tasodifiy heksamerlardan foydalanish uchun talab qilinadi.Oligo (dT) dan foydalanganda ushbu bosqichni o'tkazib yuboring.18yoki Genga xos primer.
2) b.Tavsiya etilgan teskari transkripsiya harorati 42 ° C, murakkab ikkilamchi tuzilmalar yoki yuqori GC tarkibiga ega bo'lgan shablonlar uchun reaktsiya haroratini 50-55 ° C gacha ko'tarish tavsiya etiladi.
3) c.Teskari transkriptazani inaktivatsiya qilish uchun 5 daqiqa davomida 85 ° C da isitish.
4) Mahsulot to'g'ridan-to'g'ri PCR yoki qPCR reaktsiyalarida ishlatilishi mumkin yoki qisqa muddatli saqlash uchun -20 ° C da saqlanishi mumkin.Uzoq muddatli saqlash uchun mahsulotlarni bir-biriga bog'lash va -80 ° C haroratda saqlash tavsiya etiladi.Tez-tez muzlashdan saqlaning.
5) Mahsulot bir bosqichli RT-qPCR uchun javob beradi, har bir 25mL reaktsiya tizimi uchun 10-20 U teskari transkriptaza qo'shish yoki haqiqiy vaziyatga qarab teskari transkriptaza miqdorini asta-sekin oshirish tavsiya etiladi.
Eslatmalar
1.Iltimos, tajriba maydonini toza tuting;Ish paytida toza qo'lqop va niqob kiyish kerak.Tajribada ishlatiladigan barcha sarf materiallari RNase ifloslanishini oldini olish uchun RNase bo'lmasligi kerak.
2.RNK degradatsiyasini oldini olish uchun barcha protseduralar muz ustida bajarilishi kerak.
3.Teskari transkripsiyaning yuqori samaradorligini ta'minlash uchun yuqori sifatli RNK namunalari tavsiya etiladi.
4.Ushbu mahsulot faqat tadqiqot uchun mo'ljallangan.
5.Iltimos, xavfsizligingiz uchun laboratoriya xalatlari va bir martalik qo'lqoplar bilan ishlang.
