PNGase F
Peptid-N-Glikosidaza F (PNGase F) deyarli barcha N-bog'langan oligosakkaridlarni glikoproteinlardan olib tashlashning eng samarali fermentativ usuli hisoblanadi.PNGase F amidaza bo'lib, u N-bog'langan glikoproteinlardan yuqori mannoz, gibrid va murakkab oligosakkaridlarning eng ichki GlcNAc va asparagin qoldiqlari o'rtasida parchalanadi.
Ilova
Bu ferment oqsillardan uglevod qoldiqlarini olib tashlash uchun foydalidir.
Tayyorlash va spetsifikatsiya
| Tashqi ko'rinish | Rangsiz suyuqlik |
| Proteinning tozaligi | ≥95% (SDS-PAGE dan) |
| Faoliyat | ≥500 000 U/ml |
| Ekzoglikozidaza | Hech qanday faoliyat aniqlanmadi (ND) |
| Endoglikozidaza F1 | ND |
| Endoglikozidaza F2 | ND |
| Endoglikozidaza F3 | ND |
| Endoglikosidaza H | ND |
| Proteaz | ND |
Xususiyatlari
| EC raqami | 3.5.1.52(Mikroorganizmdan rekombinant) |
| Molekulyar og'irlik | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektrik nuqta | 8. 14 |
| Optimal pH | 7,0-8,0 |
| Optimal harorat | 65 °C |
| Substratning o'ziga xosligi | GlcNAc va asparagin qoldiqlari o'rtasidagi glikozid aloqalarining uzilishi 1-rasm. |
| Tan olish saytlari | N-bog'langan glikanlar, agar tarkibida a1-3 fukoza bo'lmasa, 2-rasm |
| Aktivatorlar | DTT |
| Inhibitor | SDS |
| Saqlash harorati | -25 ~ -15 ℃ |
| Issiqlik inaktivatsiyasi | 1 µL PNGase F o‘z ichiga olgan 20 µL reaksiya aralashmasi 75 °C da 10 daqiqa davomida inkubatsiya orqali inaktivlanadi. |
1-rasm PNGase F ning substrat o'ziga xosligi
2-rasm PNGase F ning tan olinishi.
Ichki GlcNAc qoldiqlari a1-3 fukoza bilan bog'langanda, PNGase F N-bog'langan oligosakkaridlarni glikoproteinlardan ajrata olmaydi.Ushbu modifikatsiya o'simliklar va ba'zi hasharotlar glikoproteinlarida keng tarqalgan.
Cmuxoliflar
|
| Komponentlar | Diqqat |
| 1 | PNGase F | 50 mkl |
| 2 | 10 × glikoproteinni denaturatsiya qiluvchi bufer | 1000 mkl |
| 3 | 10 × GlikoBufer 2 | 1000 mkl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 mkl |
Birlik ta'rifi
Bir birlik(U) umumiy reaksiya hajmi 10 mkL boʻlgan 37°C da 10 mkg denaturatsiyalangan RNaz B dan 1 soat ichida >95% uglevodni olib tashlash uchun zarur boʻlgan ferment miqdori sifatida aniqlanadi.
Reaktsiya shartlari
1. 1-20 mkg glikoproteinni deionizatsiyalangan suv bilan eritib oling, 1 µl 10 × glikoprotein denaturatsiya qiluvchi tampon va H2O (agar kerak bo‘lsa) qo‘shing, 10 µl umumiy reaksiya hajmini hosil qiling.
2.100 ° C da 10 daqiqa davomida inkubatsiya qiling, muz ustida sovutib oling.
3.2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 qo‘shing va aralashtiring.
4.1-2 µl PNGase F va H qo‘shing2O (agar kerak bo'lsa) 20 µl umumiy reaksiya hajmini hosil qiling va aralashtiring.
5.Reaksiyani 37°C da 60 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.
6.SDS-PAGE tahlili yoki HPLC tahlili uchun.
