mag'rur
Mahsulotlar
Yuqori rentabellikli T7 in vitro transkripsiya reaktivi (Termostable) HCP0036A Tavsiya etilgan rasm
  • Yuqori rentabellikli T7 in vitro transkripsiya reaktivi (Termostable) HCP0036A

Yuqori rentabellikdagi T7 in vitro transkripsiya reagenti (Termostabil)


Mushuk raqami: HCP0036A

Paket: 50T

Yuqori rentabellikli T7 in vitro transkripsiya reagenti to'plami (Termostable) 50 ° C gacha yuqori haroratlarda in vitro transkripsiyaga qodir.

Mahsulot tavsifi

Mahsulot ma'lumotlari

Yuqori rentabellikli T7 in vitro transkripsiya reagenti to'plami (Termostable) 50 ° C gacha yuqori haroratlarda in vitro transkripsiyaga qodir.To'plam T7 promouterini shablon sifatida va NTPlarni substrat sifatida o'z ichiga olgan chiziqli ikki zanjirli DNK yordamida yuqori rentabellikdagi RNK transkriptlarini sintez qilish imkoniyatiga ega.To'plam biotin yorlig'i, bo'yoq yorlig'i va radio etiketli RNK olish uchun o'zgartirilgan nukleotidlarni kiritish uchun javob beradi.To'plam, shuningdek, qopqoq analoglari bilan birgalikda transkripsiyalangan mRNKlarni sintez qilishda ham qo'llanilishi mumkin.To'plam muqobil sifatida o'zgartirilgan N1-Me-pUTP nukleotidlarini o'z ichiga oladi.

Har bir standart reaksiya 1 mkg DNK shablonidan 150-200 mkg gacha RNK hosil qiladi.Reaktsiya hajmini kerak bo'lganda milligramm darajasidagi RNK hosil qilish uchun kattalashtirish mumkin.

To'plamdan sintez qilingan RNK ko'plab ilovalar uchun mos keladi, shu jumladan RNK tuzilishi va funktsiyasini o'rganish, ribozim biokimyosi, RNaz himoyasi tahlillari va gibridizatsiyaga asoslangan blotlar, anti-sens RNK va RNKi tajribasi.To'plamdan sintez qilingan RNK, shuningdek, in vitro translatsiya uchun ishlatiladigan RNKning barqarorligi va translatsiya qobiliyatini yaxshilash uchun vaktsinani yopish fermenti va 2'-O-metiltransferaza tomonidan yopiq RNKning fermentativ ishlab chiqarilishi va Poli(A) polimeraza bilan biriktirilishi uchun javob beradi. , transfeksiya va mikroin'ektsiya.


  • Oldingi:
  • Keyingisi:

  • Komponentlar

    Komponent

    Diqqat

    Ovoz balandligi

    ATP

    100 mM

    100 mkl

    CTP

    100 mM

    100 mkl

    GTP

    100 mM

    100 mkl

    UTP

    100 mM

    100 mkl

    N1-Me-pUTP

    100 mM

    100 mkl

    10 × Yuqori rentabellikli IVT bufer A

    /

    100 mkl

    Ferment aralashmasi (termostabil)

    /

    100 mkl

     

    Saqlash shartlari

    0°C ostida tashish va -25~-15°C da saqlash.

     

    Protokol

    •DNK shablonini tayyorlash

    Linearlashtirilgan plazmid DNK, PCR mahsulotlari yoki sintetik DNK oligonükleotidlari to'plam bilan in vitro transkripsiyasi uchun shablon sifatida ishlatilishi mumkin. DNK shablonini TE buferida yoki RNazsiz ddH2O ichida eritish mumkin.

    Plazmid andozalar: Linearizatsiyalangan plazmidda DNK shabloni sifatida T7 promotor mintaqasi bo'lishi kerak.Chiziqli plazmidning sifati RNKning hosildorligi va yaxlitligiga ta'sir qiladi.To'liq chiziqli plazmid shablonining eng yuqori tozaligi to'plamdan muvaffaqiyatli foydalanish uchun juda muhimdir, chunki dairesel plazmid samarali tarzda tugatilmaydi.Transkripsiyaning eng yuqori rentabelligi eng yuqori toza shablon bilan erishiladi.Belgilangan uzunlikdagi RNK transkriptini ishlab chiqarish uchun plazmid DNK to'mtoq uchlari yoki 5'-o'simtalar hosil qiluvchi cheklovchi ferment bilan to'liq chiziqli bo'lishi kerak.Laboratoriya usullari bilan tozalangan chiziqli plazmid RNaz, oqsil, RNK va tuzlarni ifloslantiruvchi moddalardan xoli bo'lishi mumkin.

     PCR shablonlar: To'g'ri yo'nalishda T7 RNK polimeraza promouterini o'z ichiga olgan PCR mahsulotlarini transkripsiya qilish mumkin.PCR aralashmalari to'g'ridan-to'g'ri ishlatilishi mumkin bo'lsa-da, tozalangan PCR mahsulotlari bilan yaxshi hosil olinadi.

    • Sintetik DNK oligonukleotidlar:Sintetik DNK oligonükleotidlari to'liq ikki zanjirli yoki asosan bir ipli ikki zanjirli T7 promotor ketma-ketligi bilan transkripsiya qilinishi mumkin.

    RNK sintezi protokollari

    RNase kontaminatsiyasini oldini olish uchun qo'lqop kiyish va nukleazsiz naychalar va reagentlardan foydalanish tavsiya etiladi.Kichik hajmdagi reaktsiyalar nukleazsiz mikrofuga naychalarida yoki PCR tasma naychalarida yig'ilishi kerak.

    An'anaviy RNK sintezi

    1.To'plamning kerakli qismlarini eritib oling, aralashtiring va naychalar tubiga eritma to'plash uchun mikrofugada pulsli aylantiring.Muz ustida turing.

    2.Agar siz ko'p reaktsiyalarni amalga oshirishni rejalashtirmoqchi bo'lsangiz, teng hajmdagi 10 × Hi-Yield IVT Bufer va to'rtta ribonukleotid (NTP) eritmalarini birlashtirib, asosiy aralashmani tayyorlash qulay.Har bir reaksiya uchun 10 µl master-miksdan foydalaning.

    3. Reaksiyani xona haroratida quyidagi tartibda yig‘ing:

    Reaktiv

    Miqdori

    Nukleazsiz suv

    X mL

    10 × Yuqori rentabellikli IVT bufer A

    2 mL

    ATP/CTP/GTP/UTP *(har biri 100 mM)

    Har biri 2 mL (har biri 10 mM final)

    Shablon DNK

    Y mkl (1 mkg)

    Ferment aralashmasi (termostabil)

    2 mL

    Jami reaksiya hajmi

    20 mkl

    * Mahsulotning immunogenligini pasaytirish uchun UTP bir xil yakuniy konsentratsiyada N1-Me-pUTP bilan almashtirilishi mumkin.

    4. Yaxshilab aralashtiramiz, mikrofujda puls-spin.2 soat davomida 37 ° C da, agar yuqori harorat reaktsiyasi kerak bo'lsa, 1 soat davomida 50 ° C da inkubatsiya qiling.

    5. DNK hazm qilish: Shablon DNKni olib tashlash uchun har 20 mkL reaktsiyaga 10U DNase I qo'shing, yaxshilab aralashtiring va 37 ℃ da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.

     

    Qopqoqli RNK sintezi

    An'anaviy RNK sinteziga o'xshash protokol, reaktsiyani yig'ish bosqichidan tashqari.Xona haroratida yopiq RNK sintezi reaktsiyasini quyidagi tartibda yig'ing:

    Reaktiv

    Miqdori

    Nukleazsiz suv

    X mL

    10 × Yuqori rentabellikli IVT bufer A

    2 mL

    ATP/CTP/GTP/UTP *(har biri 100 mM)

    Har biri 2 mL (har biri 10 mM final)

    Qopqoq analogi (100 mM)

    1,6 mL

    Shablon DNK

    Y mkl (1 mkg)

    Ferment aralashmasi (termostabil)

    2 mL

    Jami reaksiya hajmi

    20 mkl

    *** Agar kerak bo'lsa, Cap1 (3'OH AG) va cap1 (3'OMe AG) ascap analoglaridan foydalanish mumkin.Bizning hamkorlikdagi transkripsiya reagentimiz Co-capping T7 invitro transkripsiya reagenti (pUTP, CAP GAG (3'OMe), pUTP, CAP GAG, N1-Me-pUTP, CAP GAG (3'OMe) va N1-Me-pUTP, CAP) tavsiya etiladi. GAG.

     

    mRNKni tozalash

    • Fenol: Xloroform qo'shimchaharakat va etanol Yog'ingarchilik

    Oqsillarni va erkin nukleotidlarning ko'p qismini olib tashlash uchun fenol: xloroformni ekstraktsiyalash va RNK transkriptlarini etanol bilan cho'ktirish afzalroq usuldir.

    1. 160 mkL nukleazsiz suv qo'shib reaksiya hajmini 180 mkL ga sozlang.20 mL 3M natriy asetat, pH5,2 qo'shing, yaxshilab aralashtiring.

    2. 1:1 fenol/xloroform aralashmasidan teng hajmdagi ekstrakt, 10000 rpm tezlikda 5 daqiqa davomida sentrifuga qiling.Suvli fazani to'plang va yangi naychaga o'tkazing.

    3. Xloroform miqdori teng bo'lgan ikkita ekstraktsiyadan keyin.Suvli fazani to'plang va yangi naychaga o'tkazing.

    4. RNK 2 hajm etanol bilan cho'ktirildi.-20 ℃ da kamida 30 daqiqa inkubatsiya qiling va palletni 15 daqiqa davomida santrifüjlash orqali yig'ing.Supernatantni ehtiyotkorlik bilan olib tashlang.

    5. Paletani 150 mkL~200 mkl sovuq 70% etanol bilan yuving.

    6. Paletani havoda 2 daqiqa quriting va 100 mkL~200 mL RNazsiz suv yoki boshqa tamponlarda qayta suspenziya qiling.

     

    • LiCl yog'inlari

    RNKning LiCl cho'kmasi birlashtirilmagan NTP va fermentlarning ko'pini olib tashlashda samarali bo'ladi.

    1. LiCl eritmasidan (5M) teng miqdorda qo'shing, yaxshilab aralashtiring.

    2. -20℃ da kamida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.RNK palletlari uchun 4℃ da 12000 aylanish tezligida 15 daqiqa davomida santrifüj qiling.Supernatantni ehtiyotkorlik bilan olib tashlang.

    3. 200 mkL oldindan sovutish 70% etanol qo'shib, sxemasidan qatron qiling.Etanolni ehtiyotkorlik bilan olib tashlang.Bosqichlarni 2-3 marta takrorlang.

    4. Paletani 5~10 daqiqa davomida havo bilan quriting va 100 mkL~200 mL RNazsiz suv yoki boshqa buferlarda qayta suspenziya qiling.

    • Aylantirish ustunni tozalash

    Spin ustunlari birlashtirilmagan NTPlarni, oqsillarni va tuzlarni olib tashlaydi.

    • Magnit boncuk puriuydirma

    Magnit boncuklarni tozalash birlashtirilmagan nukleotidlarni, oqsillarni va tuzlarni olib tashlashi mumkin.

     

    Reaksiya mahsulotlarini miqdoriy aniqlash

    • U tomonidan miqdorni aniqlashV yorug'lik absorbsiyasi: Reaksiya mahsulotlarini tozalash kerak, chunki reaksiya aralashmalaridagi har qanday korporatsiyalanmagan nukleotidlar va shablon DNKlari o'qishga ta'sir qiladi.UV spektrofotometriyasini 260 nm da o'lchash RNK ​​kontsentratsiyasini osongina olish mumkin.Bir zanjirli RNK uchun 1 A260 40 mkg/ml RNK konsentratsiyasiga to'g'ri keladi.

     Miqdorni aniqlash by bo'yoq: Reaksiya mahsulotlarini miqdorini aniqlash Ribogreen bo'yog'i bilan tozalashsiz ishlatilishi mumkin, chunki birlashtirilmagan nukleotidlar RNK mahsulotlarini baholashga ta'sir qilmaydi.

      

    Eslatmalar

    • Transkripsiya reaktsiyasi RNazsiz muhitda amalga oshirilishi kerak.Qo'lqop kiyish tavsiya etiladi.Maslahatlar, naychalar va suv yadrosiz bo'lishi kerak.

    • NTPlarning barcha optimal yakuniy konsentratsiyasi 10 mM ni tashkil qiladi va siz NTPlarning yakuniy kontsentratsiyasini haqiqiy holatga ko'ra o'zgartirishingiz mumkin.

    • RNK sintezi reaktsiyasi aralashmasi xona haroratida tayyorlanishi kerak, chunki DNK spermidin ishtirokida 4°C da cho'kishi mumkin.

    • Agar shablon DNK to'liq chiziqli bo'lmasa, to'g'ri uzunlikdagi transkriptlarning rentabelligi kamayadi.

    • Reaksiya aralashmasini kattalashtirish yoki kamaytirish mumkin.

    • Qayta eritilgandan keyin buferda erimaydigan moddalar borligi aniqlansa, ishlatishdan oldin buferni erimaydigan moddalar to'liq eriguncha aralashtiring.

    • Transkriptlari 300 bp dan qisqa bo'lgan reaktsiyalar uchun 37 ℃ da 4-8 soat inkubatsiya sizga yuqori hosil berishi kerak.

    • Standart RNK sintezi transkriptlari uchun foydalaniladigan DNK shablonida T7 promotor ketma-ketligidan so'ng GGG boshlash ketma-ketligi bo'lishi kerak, chunki T7 RNK polimeraza GTP ga yuqori yaqinlikka ega.

    • Ko-transkripsiya tizimi bilan mRNK sintezi uchun foydalaniladigan DNK shablonida T7 promotor ketma-ketligidan keyin AGG boshlash ketma-ketligi bo'lishi kerak.

    Muammolarni bartaraf qilish; nosozliklarni TUZATISH

    a) to'liq lenaning past rentabelligigth RNK:

    Agar transkripsiya reaktsiyasi to'liq uzunlikdagi RNKni hosil qilsa, lekin hosil kutilganidan sezilarli darajada past bo'lsa, DNK shablonidagi ifloslantiruvchi moddalar RNK polimerazasini inhibe qilishi yoki DNK kontsentratsiyasi juda past yoki noto'g'ri bo'lishi mumkin.

    Taklif: DNK shablonini qo'shimcha tozalash tavsiya etiladi.

     

    b) RNK transkript surtish denaturing Jel:

    Agar RNK denaturatsiya qiluvchi agaroza yoki poliakrilamid jelida degradatsiyaga uchragan bo'lsa, DNK shabloni yoki tajriba jarayoni RNase bilan ifloslangan.

    Taklif: Agar plazmid DNK shabloni RNase bilan ifloslangan bo'lsa, fenol/xloroform ekstraktsiyasini va etanol cho'kmasini bajaring.Tajriba davomida ishlatiladigan uchlar va naychalar RNazsiz ekanligiga ishonch hosil qiling.Iltimos, laboratoriya xalati, niqob va bir marta ishlatiladigan qo'lqop kiying.

     

    c) RNK ning transkripti kutilganidan kattaroq hajm:

    Agar RNK transkripti denaturatsiya qiluvchi jelda kutilganidan kattaroq ko'rinsa, plazmid DNK shablonlari to'liq hazm bo'lmagan bo'lishi mumkin.Kuchli ikkilamchi tuzilmalarning mavjudligi RNK transkriptining to'liq denatüratsiya qilinmasligiga olib kelishi mumkin.

    Taklif: Shablonni to'liq hazm qilish uchun tekshiring, agar hazm bo'lmagan plazmid tasdiqlansa, cheklovchi ferment hazm qilishni takrorlang.Ketma-ketlikni loyihalash bosqichida DNK shablonining ikkilamchi tuzilmalarini kamaytiring.

     

    d) RNK transkript ning kichikroq hajmi dan kutilgan:

    Agar denaturatsiya jeli tahlili kutilgan o'lchamdan kichikroq chiziqlar mavjudligini ko'rsatsa, bu polimeraza tomonidan muddatidan oldin tugatilishi bilan bog'liq.T7 RNK polimerazasini tugatish signallariga o'xshash ba'zi ketma-ketliklar muddatidan oldin tugatishga olib keladi.

    Taklif: Transkripsiya reaktsiyasini pastroq haroratlarda, masalan, 30 ° C da inkubatsiya qilish, to'liq uzunlikdagi transkriptning ulushini oshirishi mumkin, ammo hosil kamayadi.GCga boy shablonlar yoki ikkilamchi tuzilmalarga ega shablonlar uchun 42°C da inkubatsiya toʻliq uzunlikdagi transkript hosildorligini oshirishi mumkin.

    Xabaringizni shu yerga yozing va bizga yuboring