RTL teskari transkriptaza
RTL teskari transkriptaza RNK shabloniga bog'liq DNK polimeraza bo'lib, 3'→5' ekzonukleaza faolligiga ega emas va RNase H faolligiga ega.Bu ferment RNK dan qo'shimcha DNK zanjirini sintez qilish uchun shablon sifatida foydalanishi mumkin, bu birinchi zanjirli cDNK sinteziga, ayniqsa RT-LAMP (loop-vositalangan izotermik kuchaytirish) uchun qo'llanilishi mumkin.RTL teskari transkriptaza 1.0 bilan solishtirganda, sezuvchanlik sezilarli darajada yaxshilanadi, termal barqarorlik kuchliroq va 65 ° C da reaktsiya barqarorroq.RTL teskari transkriptaza (glitserinsiz) liyofillangan preparatlar, liyofillangan RT-LAMP reagentlari va boshqalarni tayyorlash uchun ishlatilishi mumkin.
Birlik ta'rifi
Bir birlik poli(A)•oligo(dT)25 shablon-primer sifatida 50°C da 20 daqiqada kislotali cho‘kma materialga 1 nmol dTTP ni kiritadi.
Komponentlar
| Komponent | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL teskari transkriptaza (glitserinsiz) (15U/mkl) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL buferi | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Saqlash holati
0 ° C ostida tashish va -25 ° C ~ -15 ° C haroratda saqlanadi.
Sifat nazorati
- ning qoldiq faoliyatiEnodonukleaz:1 mkg lDNK va 15 birlik RTL2.0 ni o'z ichiga olgan 50 mL reaktsiya 37 ℃ da 16 soat davomida inkubatsiya qilingan, jel elektroforezi bilan salbiy nazorat bilan bir xil naqshni ko'rsatadi.
- ning qoldiq faoliyatiEksonukleaza:1 mkg Hind Ⅲ hazm qilingan lDNK va 15 birlik RTL2.0 ni o'z ichiga olgan 50 mL reaktsiya 37 ℃ da 16 soat davomida inkubatsiya qilingan, jel elektroforezi bilan salbiy nazorat bilan bir xil naqshni ko'rsatadi.
- ning qoldiq faoliyatiNikase:37°C da 4 soat davomida inkubatsiya qilingan 1 mkg o'ta o'ralgan pBR322 va 15 birlik RTL2.0 ni o'z ichiga olgan 50 mkl reaktsiya jel elektroforezi orqali salbiy nazorat bilan bir xil naqshni ko'rsatadi.
- ning qoldiq faoliyatiRNase:37°C da 4 soat davomida inkubatsiya qilingan 0,48 mkg MS2 RNK va 15 birlik RTL2.0 ni o'z ichiga olgan 10 mkl reaktsiya jel elektroforezi orqali salbiy nazorat bilan bir xil naqshni ko'rsatadi.
- E. coli gDNK:bilan o'lchanadiE.colimaxsus HCD aniqlash to'plamlari， 15 birlik RTL2.0 1 dan kamroqni o'z ichiga oladiE. coligenom.
Reaktsiyani sozlash
cDNK sintez protokoli
| Komponentlar | Ovoz balandligi |
| Shabloni RNK a | ixtiyoriy |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) yoki Tasodifiy astar aralashmasi (60uM) | 2 mL |
| dNTP aralashmasi (har biri 10 mM) | 1 mkl |
| RNaz inhibitori (40U/uL) | 0,5 mL |
| RTL teskari transkriptaza 2.0 (15U/uL) | 0,5 mL |
| 10×HC RTL buferi | 2 mL |
| Nukleazsiz suv | 20 mL gacha |
Eslatmalar:
1) Umumiy RNKning tavsiya etilgan dozasi 1ng~1mkg
2) mRNKning tavsiya etilgan dozasi 50ng ~ 100ng edi
Termo-velosipedda yurish Muntazam ishlash uchun shartlar reaktsiya:
| Harorat (°C) | Vaqt |
| 25 °Ca | 5 daqiqa |
| 55 °C | 10 daqiqab |
| 80 °C | 10 daqiqa |
Eslatmalar:
1) Tasodifiy primer aralashmasi ishlatilsa, 25 ° C da inkubatsiya bosqichi.
2) Agar maqsadli primer aralashmasi ishlatilsa, 55 ° C da 10 ~ 30 daqiqa davomida inkubatsiya bosqichi.
RT-LAMP protokoli
| Komponentlar | Ovoz balandligi | Yakuniy konsentratsiya |
| Shablon RNK | ixtiyoriy | ≥10 nusxa |
| dNTP aralashmasi (10mM) | 3,5 mkl | 1,4 mM |
| FIP/BIP primerlari (25×) | 1 mkl | 1,6 mkM |
| F3/B3 primerlari (25×) | 1 mkl | 0,2 mkM |
| LoopF/LoopB primerlari (25×) | 1 mkl | 0,4 mkM |
| RNaz inhibitori (40U/mkl) | 0,5 mL | 20 U/reaktsiya |
| RTL teskari transkriptaza 2.0 (15U/mkl) | 0,5 mL | 7,5 U/reaktsiya |
| Bst V2 DNK polimeraza (8U/mkl) | 1 mkl | 8 U/reaktsiya |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 mkl | 6 mM (jami 8 mM) |
| 10×HC RTL buferi (yoki 10×HC Bst V2 buferi) | 2,5 mkl | 1 × (2mM Mg2+) |
| Nukleazsiz suv | 25 mL gacha | - |
Eslatmalar:
1) Vorteks orqali aralashtiriladi va yig'ish uchun qisqa vaqt santrifüj qilinadi.1 soat davomida 65 ° C da doimiy haroratda inkubatsiya.
2) Ikki bufer o'zaro ishlaydi va bir xil tarkibga ega.
Eslatmalar
1.Ushbu mahsulot -20 °C da saqlanganida oq rangli qattiq modda hosil qiladi.Uni -20 ° C dan olib tashlang va taxminan 10 daqiqa muzga qo'ying.Eritgandan keyin uni chayqash va aralashtirish orqali ishlatish mumkin.
2. cDNK mahsuloti -20 ° C yoki -80 ° C da saqlanishi yoki darhol PCR reaktsiyasi uchun ishlatilishi mumkin.
3.RNase kontaminatsiyasini oldini olish uchun, iltimos, tajriba maydonini toza tuting va ish paytida toza qo'lqop va niqob taqing.
