5 × Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Mushuk raqami: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) - bu bir bosqichli teskari transkripsiya va miqdoriy PCR (qRT-PCR) uchun mos bo'lgan yuqori barqaror bir naychali zondga asoslangan aralash.Astarlar va problarni oldindan aralashtirishni qo'llab-quvvatlaydi va past haroratda uzoq vaqt saqlashdan keyin barqaror bo'lib qoladi.Sinov qilinadigan namunani qo'shimcha trubkani ochish/pipetlash operatsiyasisiz foydalanilganda to'g'ridan-to'g'ri qo'shish mumkin.Ushbu mahsulot komponentlar bilan ta'minlaydi, masalan, issiq ishga tushiriladigan DNK polimeraza, M-MLV, issiqlikka chidamli urasil DNK glikosilaz (TS-UNG), RNase inhibitori, MgCl2, dNTPlar (dTTP o'rniga dUTP bilan) va stabilizatorlar.Genetik jihatdan o'zgartirilgan tezkor kuchaytiruvchi teskari transkriptaza va DNK polimeraza yordamida PCR kuchaytirilishini 20-40 daqiqada yakunlash mumkin.Ushbu reagent antiinhibitor kuchaytiruvchi ferment va UNG fermenti aralash fermentlari bilan qPCR uchun maxsus buferdan foydalanadi.Shuning uchun u maqsadli genlarning yaxshi kuchaytirilishini olishi va PCR qoldiqlari va aerozol ifloslanishidan kelib chiqqan noto'g'ri kuchaytirilishining oldini olishi mumkin.Ushbu reagent Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad va Roche kabi ishlab chiqaruvchilarning ko'pgina floresan miqdoriy PCR asboblari bilan mos keladi.
Komponent
1.25 × Neoscript Fast RTase/UNG aralashmasi
2.5 × Neoscript Fast RT Premix buferi (dUTP)
Saqlash shartlari
Barcha komponentlar uzoq muddatli saqlash uchun -20 ℃ va 3 oygacha 4 ℃ haroratda saqlanishi kerak.Iltimos, eritishdan keyin yaxshilab aralashtiriladi va ishlatishdan oldin santrifüj qilinadi.Tez-tez muzlashdan saqlaning.
qRT-PCR reaktsiya tizimini tayyorlash
| Komponentlar | 25mLTizim | 50mLTizim | Yakuniy konsentratsiya |
| 5 × Neoscript Fast RT Premix buferi (dUTP) | 5 mkl | 10 mkl | 1× |
| 25 × Neoscript Fast RTase/UNG aralashmasi | 1 mkl | 2 mkl | 1× |
| 25 × Primer-zond aralashmasia | 1 mkl | 2 mkl | 1× |
| Shablon RNKb | - | - | - |
| ddH2O | 25 mkl gacha | 50 mkl gacha | - |
1) a. Primerning yakuniy konsentratsiyasi odatda 0,2 mkM ni tashkil qiladi.Yaxshiroq natijalarga erishish uchun primer konsentratsiyasini 0,2-1 mkM oralig'ida optimallashtirish mumkin.Odatda, prob konsentratsiyasini 0,1-0,3 mkM oralig'ida optimallashtirish mumkin.
2) b. Tezkor PCR protsedurasidan foydalanilganda, primerlar va zondlar kontsentratsiyasini oshirish kuchaytirish natijalarini yaxshilashga olib kelishi mumkin va ularning nisbati mos ravishda optimallashtirilishi kerak.
3) Har xil turdagi namunalar turli xil turlari va tarkibidagi inhibitor va maqsadli genning nusxasi sonini o'z ichiga oladi.Namuna hajmi haqiqiy holatga qarab hisobga olinishi kerak.Agar kerak bo'lsa, namunani nukleazsiz suv yoki TE buferi bilan suyultiring.
Reaksiya Cshartlar
| Muntazam PCR protsedurasi | Tez PCR protsedurasi | ||||||
| Jarayon | Temp. | Vaqt | Velosiped | Jarayon | Temp. | Vaqt | Velosiped |
| Teskari transkripsiya | 50℃ | 10-20 daqiqa | 1 | Teskari transkripsiya | 50℃ | 5 daqiqa | 1 |
| Polimeraza Faollashtirish | 95℃ | 1-5 daqiqa | 1 | Polimeraza Faollashtirish | 95℃ | 30s | 1 |
| Denaturatsiya | 95℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturatsiya | 95℃ | 1-3s | 40-50 |
| Yuvish va Kengaytma | 56-64 ℃ | 20-60s | Yuvish va Kengaytma | 56-64 ℃ | 3-20s | ||
Sifat nazorati
1.Funktsiyani aniqlash: qPCR ning sezgirligi, o'ziga xosligi va takrorlanishi.
2.Ekzogen nukleaza faolligi yo'q: ekzogen endonukleaza va ekzonukleaza ifloslanishi yo'q.
Eslatmalar
1.Tez DNK polimerazasini kuchaytirish tezligi 1kb/10s dan kam emas.Turli xil PCR asboblari har xil isitish va sovutish tezligiga, haroratni nazorat qilish rejimlariga va issiqlik o'tkazuvchanligiga ega, shuning uchun maxsus tezkor PCR asbobingiz bilan birgalikda primer/zond konsentratsiyasini va ishlash usulini optimallashtirish juda muhimdir.
2.Ushbu mahsulot keng qo'llanilishini amalga oshiradi va u yuqori sezuvchanlik molekulyar diagnostika uchun javob beradi.Uch bosqichli PCR usuli past haroratga ega primerlar uchun yoki 200 bp dan ortiq uzun bo'laklarni kuchaytirish uchun tavsiya etiladi.
3.Turli amplikonlar dUTP dan foydalanish samaradorligi va UNGga nisbatan har xil sezuvchanlikka ega bo'lganligi sababli, UNG tizimidan foydalanganda aniqlash sezgirligi pasaysa, reagentlar optimallashtirilishi kerak.Agar kerak bo'lsa, texnik yordam uchun biz bilan bog'laning.
4.O'tkazish PCR mahsulotlarini kuchaytirmaslik uchun kuchaytirish uchun maxsus tajriba maydoni va pipetka kerak.Qo'lqop bilan ishlang va tez-tez almashtiring va kuchaytirilgandan keyin PCR trubkasini ochmang.
