DNK ekstraktsiyasi uchun mini to'plam
Ushbu to'plam optimallashtirilgan bufer tizimi va silika jeli ustunini tozalash texnologiyasini qo'llaydi, bu TAE yoki TBE agaroz jelining turli konsentratsiyasidan 70 bp - 20 kb DNK parchalarini tiklashi mumkin.DNK adsorbsion ustuni yuqori tuz sharoitida DNKni maxsus adsorplashi mumkin.Bundan tashqari, to'plam PCR mahsulotlaridan, fermentativ reaktsiya tizimlaridan yoki boshqa usullar bilan olingan xom DNK mahsulotlaridan to'g'ridan-to'g'ri DNK parchalarini tozalashi va oqsillar, boshqa organik birikmalar, noorganik tuz ionlari va oligonükleotid primerlari kabi aralashmalarni olib tashlashi mumkin.Bu tozalashning 10-15 daqiqa ichida bajarilishini ta'minlashi mumkin.Tozalangan DNK to'g'ridan-to'g'ri bog'lash, transformatsiya, ferment hazm qilish, in vitro transkripsiya, PCR, sekvensiya, mikroin'ektsiya va boshqalar uchun ishlatilishi mumkin.
Saqlash shartlari
-15 ~ -25 ℃ haroratda saqlang va xona haroratida tashish.
Komponentlar
| Komponentlar | (100 rxns) |
| Bufer YaIM | 80 ml |
| Bufer GW | 2 × 20 ml |
| Elyusiya buferi | 20 ml |
| FastPure DNK Mini Ustunlari-G | 100 |
Bufer YaIM:DNKni bog'lovchi bufer.
Bufer GW:Yuvish buferi;ishlatishdan oldin shishada ko'rsatilgan hajmda mutlaq etanol qo'shing.
Elutsiya buferi:Elutsiya.
FastPure DNK Mini Ustunlari-G:DNKning adsorbsion ustunlari.
Yig'ish naychalari 2 ml:Filtrlash uchun yig'ish quvurlari.
Tayyorlangan materiallar
1,5 ml sterillangan naychalar, mutlaq etanol va izopropanol (DNK fragmenti ≤100 bp bo'lganda, 1 hajm qo'shing.
izopropanoldan 1 hajmli jelga), suv hammomi.
Tajriba jarayoni
Ishlatishdan oldin yorliqda ko'rsatilgan Bufer GWni suyultirish uchun 80 ml etanol qo'shing, xona haroratida saqlang.
Mexanizm
1. PCR reaktsiyasi eritmasi
Jel ekstraktsiyasi sxemasi: Teng hajmdagi Bufer GDP PCR reaktsiyasi eritmasini tiklash sxemasini qo'shing:Ovoz balandligi buferini 5 marta qo'shing
2. YaIM Gel hajmini hisoblang (100 μl 100 mg ga teng)
Jelni eritib yuboring
3. 50 ~ 55 gacha oldindan qizdiring℃
4. Bog'lash yuvish
300 mkL bufer YaIM qo'shing*
700 mL bufer GW qo'shing
700 mL bufer GW qo'shing
5. Elute
20 – 30 mL Elution Bufer yoki deionizatsiyalangan suv qo'shing
Eslatmalar* Ushbu bosqichsiz PCR reaktsiyasi suyuqligini tiklash
Jel chiqarish dasturi
1. DNK fragmentlarini fraksiyalash uchun DNK elektroforezidan so'ng, agaroz jelidan DNK bo'lagining bitta chizig'ini UV nurlari ostida aksizlang.Jelning ko'rinadigan namligini olish va iloji boricha qo'shimcha agarozni olib tashlash orqali jel bo'lagi hajmini kamaytirish uchun changni yutish qog'ozdan foydalanish tavsiya etiladi.Jel bo'lagini (mikrosentrifuga trubkasisiz) uning hajmini hisoblash uchun torting: 100 mg jel bo'lagining zichligi 1 g/ml bo'lsa, taxminan 100 mkl.
2. Teng hajmli tampon GDP qo'shing, 50 ~ 55 ℃ da 7-10 daqiqa davomida inkubatsiya qiling (jel hajmiga qarab, jel to'liq eriguncha inkubatsiya vaqtini sozlang).Naychani inkubatsiya paytida 2 marta aylantiring.
D Bufer YaIMning 1-3 hajmini qo'shish DNKni qayta tiklash samaradorligiga ta'sir qilmaydi.Qayta tiklanadigan DNK fragmenti <100 bp bo'lsa, 3 hajmli Bufer YaIM qo'shilishi kerak;jel bo'lagi to'liq eriganida, 1 hajm izopropanol qo'shing va yaxshilab aralashtiring, so'ngra keyingi bosqichga o'ting.
3. Namunani trubaning tubiga olib kelish uchun qisqa santrifüj qiling, FastPure DNK Mini Columns-G ni yig'ish naychalariga 2 ml kiriting, eritmani ehtiyotkorlik bilan har bir marta maksimal 700 mkl o'tkazing.
filtrlash ustunlariga vaqt, 30-60 soniya davomida 12 000 rpm (13 800 X g) da sentrifuga qiling.
4. Filtrni to'kib tashlang va kolonaga 300 mkL Bufer GDP qo'shing, xona haroratida 1 minut inkubatsiya qiling, 12 000 rpm (13 800 X g) 30-60 soniya davomida sentrifugalang.
5. Filtrni to'kib tashlang va ustunga 700 mkL Buffer GW qo'shing (mutlaq etanol qo'shilganligini oldindan tekshiring!), 30-60 soniya davomida 12,000 rpm (13,800 X g) da sentrifugalang.
D Iltimos, adsorbsion ustun devoriga Bufer GW qo'shing yoki Bufer GW orqa qopqog'ini qo'shing va naycha devoriga yopishgan tuzni to'liq yuvishga yordam berish uchun 2-3 marta teskari aralashtiring.
6. 5-bosqichni takrorlang.
D Buffer GW bilan ikki marta yuvish tuzning butunlay olib tashlanishini ta'minlashi va keyingi tajribalardagi ta'sirni bartaraf qilishi mumkin.
7. Filtrni to'kib tashlang va bo'sh ustunni 12 000 rpm (13 800 X g) da 2 minut sentrifuga qiling.
8. Ustunni toza 1,5 ml mikrotsentrifuga trubasiga soling, ustun membranasining o'rtasiga 20 - 30 mL Elyusiya Buferini qo'shing, 2 daqiqa davomida inkubatsiya qiling, so'ngra 12 000 rpm (13 800 X g) da 1 daqiqa davomida santrifüj qiling.Ustunni tashlang, olingan DNKni -20 da saqlang.
D 8-bosqichdagi supernatantni yana elutsiya qilish uchun ustunga o'tkazish va Elyusiya tamponini 55 ga (DNK fragmenti >3 kb bo'lganda) oldindan qizdirish tiklanish samaradorligini oshirish uchun foydali bo'lishi mumkin.
PCR mahsulotlarini qayta tiklash dasturi
Ushbu protokol PCR mahsulotlaridan, fermentativ reaktsiya tizimidan va boshqa xom DNK mahsulotlaridan (jumladan, genetik DNK) DNK fragmentlarini tozalash uchun qo'llaniladi.Ushbu eritma turli nukleotidlarni, primerlarni, primer dimerlarini, tuz molekulalarini, fermentlarni va boshqa aralashmalarni samarali ravishda olib tashlashi mumkin.
1. PCR mahsulotlarini, fermentativ reaktsiya eritmasini va boshqa DNK xom ashyolarini qisqacha santrifüj qiling.Pipetka yordamida ularning hajmini hisoblang va sterillangan 1,5 ml yoki 2 ml naychaga o'tkazing.100 mkl gacha bo'lgan hajmgacha ddH2O qo'shing;yuqori konsentratsiyali genomik DNK uchun esa ddH2O bilan 300 mL gacha suyultirish tiklanish samaradorligini oshirishga yordam beradi.
2. Bufer YaIMning 5 hajmini qo'shing, teskari aylantirish yoki vortekslash orqali yaxshilab aralashtiring.Qiziqarli DNK fragmenti >100 bp bo'lsa, etanolning qo'shimcha 1,5 hajmini (namunalar + Bufer YaIM) qo'shish kerak.
3. Ustunni yana yig'ish trubasiga soling, aralashmani ustunga o'tkazing, 12 000 rpm (13 800 × g) tezlikda 30 - 60 soniya davomida santrifüj qiling.Agar aralash eritmaning hajmi >700 mkl bo'lsa, adsorbsion ustunni yana yig'ish trubasiga soling, qolgan eritmani adsorbsion ustunga o'tkazing va 12 000 rpm (13 800 × g) tezlikda 30-60 soniya davomida santrifüj qiling.
4. Keyingi ishlash 08-1/Gel ekstraksiya dasturining 5-8-bosqichlariga ishora qiladi.
Ilovalar
TAE yoki TBE agaroz jelining har xil konsentratsiyasi;Turli usullar bilan olingan PCR mahsulotlari, fermentativ reaktsiya tizimlari yoki boshqa xom DNK mahsulotlari.Qayta tiklangan parchalar oralig'ida70 bp -20 kb.
Eslatmalar
Faqat tadqiqot uchun.Diagnostika muolajalarida foydalanish uchun emas.
1. Ishlatishdan oldin yorliqda ko'rsatilganidek, Buffer GW ni suyultirish uchun 80 ml etanol qo'shing, xona haroratida saqlang.
2. Agar past haroratli saqlash vaqtida Bufer YaIMni cho'ktirish oson bo'lsa, uni ishlatishdan oldin xona haroratida ma'lum vaqt davomida joylashtirish mumkin.Agar kerak bo'lsa, cho'kma to'liq eriguncha 37 ℃ suv hammomida oldindan qizdirilishi mumkin va keyin aralashtirgandan keyin foydalanish mumkin.
3. Suv hammomining haroratini oldindan 50 ~ 55 ℃ ga qo'ying.
4. 08-1/Gel ekstraksiya dasturining 1-bosqichida gel tilim hajmini minimallashtirish erish vaqtini sezilarli darajada qisqartiradi va tiklanish samaradorligini oshiradi (Linearizatsiyalangan DNK yuqori haroratda doimiy ravishda gidrolizlanadi).DNK jelini uzoq vaqt davomida UV nuriga ta'sir qilmang, chunki ultrabinafsha nurlar DNKning shikastlanishiga olib kelishi mumkin.
5. Jelni 08-1/Gel ekstraktsiya dasturining 2-bosqichida to'liq eritib yuboring, aks holda DNKni qayta tiklash samaradorligi jiddiy ta'sir qiladi.
6. Elusyon buferini yoki ddH2O ni 55 ℃ ga oldindan qizdiring, bu DNKni tozalash samaradorligini oshirishga yordam beradi.DNKni 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 - 8,5 bo'lgan eluentda saqlash tavsiya etiladi.
