EndoFree Plazmid Maxi to'plami
Ushbu to'plam bakteriyalarni lizislash uchun yaxshilangan SDS-ishqorli lizis usulidan foydalangan holda, bir kechada o'stirilgan 150-300 ml bakterial eritmadan ekstraksiya qilish uchun javob beradi.Xom ekstrakt tanlab noyob Endotoksin Scavenger bilan birlashtiriladi va endotoksinlarni olib tashlash uchun santrifüjlash orqali ajratiladi.Keyin, silika gel membranasi yuqori tuz va past pH sharoitida eritmadagi plazmid DNK bilan tanlab bog'lanadi.Shundan so'ng kirlarni va boshqa bakterial komponentlarni olib tashlash uchun yuvish buferi qo'shiladi.Nihoyat, kremniy matritsa membranasidan sof plazmid DNKni elutsiya qilish uchun past tuzli, yuqori pHli elyusiya buferi ishlatiladi.Silika jel membranasi maxsus adsorbsion membranani qo'llaydi va ustun va ustun o'rtasidagi adsorbsiya miqdori farqi juda kichik va takrorlanishi yaxshi.Fenol, xloroform va boshqa zaharli reagentlar talab qilinmaydi, shuningdek, etanolni cho'ktirish bosqichlari ham talab qilinmaydi.Ushbu to'plam 80% -90% gacha bo'lgan ekstraksiya darajasi bilan 0,2 -1,5 mg sof yuqori nusxali plazmid DNKni tezda ajratib olish uchun ishlatilishi mumkin.To'plam endotoksinni olib tashlaydigan noyob jarayon formulasidan foydalanadi, endotoksin miqdori juda past va hujayra transfeksiyasi ta'siri juda yaxshi.Olingan plazmid to'g'ridan-to'g'ri ferment hazm qilish, PCR, in vitro transkripsiya, transformatsiya, sekvensiya va boshqa molekulyar biologiya tajribalarida ishlatilishi mumkin.
Saqlash shartlari
RNaseA -30 ~ -15 ℃ da saqlanishi va ≤0 ℃ da tashilishi kerak.
Endotoksinni tozalash vositasi bir oy davomida 2 ~ 8 ℃ haroratda saqlanishi mumkin, uzoq muddatli saqlash uchun -30 ~ -15 ℃ da saqlanishi mumkin.va ≤0℃ da tashiladi.
Boshqa komponentlar xona haroratida (15 ~ 25 ℃) saqlanishi va xona haroratida tashilishi kerak.
Komponentlar
| Komponentlar | 10RXNS |
| RNaz A | 750 mkl |
| P1 buferi | 75 ml |
| P2 buferi | 75 ml |
| P4 buferi | 75 ml |
| Endotoksinlarni tozalash vositasi | 25 ml |
| Bufer PW | 2 × 22 ml |
| Bufer TB | 20 ml |
| FastPure DNK Maxi ustunlari (har biri 50 ml kollektsiyada) | 10 |
| Endotoksinsiz yig'ish trubkasi | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, RNKni olib tashlash uchun ishlatiladi.
P1 buferi:bakterial suspenziya buferi, birinchi foydalanishdan oldin bufer P1 ga RNaseA qo'shing.
P2 buferi:bakterial liziz buferi (SDS / NaOH o'z ichiga olgan).
P4 buferi:neytrallashtiruvchi bufer.
Endotoksinlarni tozalash vositasi:xom plazmid ekstraktidan endotoksinni samarali ravishda olib tashlash.
Bufer PW:buferni yuving, birinchi foydalanishdan oldin belgilangan miqdordagi etanol qo'shing.
Bufer TB:elutsiya buferi.
FastPure DNK Maxi ustunlari:plazmid DNK adsorbsiya ustunlari.
Yig'ish naychalari 50 ml:filtrat yig'ish quvurlari.
Endotoksinsiz yig'ish trubkasi:plazmid DNK yig'ish naychalari.
Tayyorlangan materiallar
Mutlaq etanol, izopropanol, 50 ml dumaloq pastki santrifüj naychalari va 50 ml endotoksinsizsantrifüj quvurlari.
Ilovalar
Ushbu mahsulot 150 - 300 ml bakterial eritmadan plazmidlarni keng miqyosda olish uchun javob beradi.bir kechada madaniyatli.
Tajriba jarayoni
1. Bir kechada o'stirilgan 150-200 ml (300 ml dan ko'p bo'lmagan) bakterial eritmani oling va soat davomida santrifüj qiling.taxminan 11 000 rpm (12 000 × g) 1 - 2 min.Supernatantni tashlang va bakteriyalarni to'plang.
D 50 ml dan ortiq bakterial eritmani yig'ishda bakteriyalarni bakterial eritma qo'shish, santrifüjlash, supernatantni tashlash va boshqa bosqichlarni bir xil 50 ml li naychada yig'ish mumkin.
bir necha marta.
2. Santrifugaga 7,5 ml bufer P1 qo'shing (iltimos, P1 buferiga RNaseA qo'shilganligini tekshiring)Bakteriyalar bo'lgan naychaga soling va vorteks yoki pipet yordamida yaxshilab aralashtiring.
D Ushbu bosqichda bakteriyalarning to'liq qayta suspenziyasi hosil qilish uchun juda muhimdir va qayta suspenziyadan keyin bakteriya to'plari bo'lmasligi kerak.Agar yaxshilab aralashtirilmagan bakteriya to'plari mavjud bo'lsa, u lizizga ta'sir qiladi, natijada unumdorlik va tozalik past bo'ladi.Agar bakterial eritmaning OD600 ko'rsatkichi 0,65 bo'lsa, 150 ml bakterial eritmadan ajratib olishda 7,5 ml P1 Buferidan foydalanish tavsiya etiladi;OD600 0,75 bo'lsa, 8 ml bufer P1 ishlatilishi kerak va P2 va P4 tamponlarining hajmlari mos ravishda o'zgartirilishi kerak.Agar bakterial eritmaning hajmi 200 ml ga oshirilsa, uni ishlatish tavsiya etiladiP1, P2 va P4 buferlarining hajmi mutanosib ravishda oshiriladi.
3. 2-bosqichdagi bakterial suspenziyaga 7,5 ml P2 tamponini qo'shing va 6-8 sekin yuqoriga va pastga aralashtiring.marta va xona haroratida 4-5 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.
D Yaxshilab aralashtirish uchun sekin teskari aylantiring.Vortekslash genomik DNK parchalanishiga olib keladi, natijada olingan plazmidda genomik DNK parchalari paydo bo'ladi.Bu vaqtda eritma yopishqoq va shaffof bo'lib, bakteriyalar to'liq parchalanganligini ko'rsatadi.Plazmidlarni yo'q qilmaslik uchun davomiyligi 5 daqiqadan oshmasligi kerak.Agar eritma aniq bo'lmasa, natijada bakteriyalar juda ko'p bo'lishi mumkinto'liq bo'lmagan liziz, shuning uchun bakteriyalar miqdori mos ravishda kamaytirilishi kerak.
4. 3-bosqichdagi bakterial suspenziyaga 7,5 ml P4 tamponini qo'shing va eritma P2 tamponini to'liq neytrallashi uchun darhol sekin 6-8 marta aylantiring.Bu vaqtda oq flokulyant cho'kma paydo bo'lishi kerak.Taxminan 11 000 rpm (12 000 × g) dan ko'proq tezlikda 10-15 daqiqa davomida santrifüj qiling, supernatantni 50 ml dumaloq tubli yangi trubkaga (o'z-o'zidan tayyorlangan) ehtiyotkorlik bilan pipetka bilan o'tkazing va undan saqlaning.suzuvchi oq cho'kmani aspiratsiya qiling.
D Bufer P4 qo'shing va yaxshilab aralashtirish uchun darhol aylantiring.Neytrallanishga ta'sir qilishi mumkin bo'lgan mahalliy yog'ingarchilikning paydo bo'lishiga yo'l qo'ymaslik uchun oq cho'kma eritma bo'ylab teng taqsimlanmaguncha naychani qoldiring.Agar santrifüjdan oldin bir xil oq flokulyant cho'kma bo'lmasa va santrifüjdan keyin supernatant aniq bo'lmasa, trubka bo'lishi mumkin.yana 5 daqiqa santrifüjlanadi.
5. 4-bosqichdan boshlab supernatantga 0,1 marta hajmdagi (10% supernatant hajmi, taxminan 2,2 ml) Endotoksin Scavenger qo'shing va aralashtirish uchun aylantiring.Eritmani muz hammomiga soling yoki eritma loyqadan shaffof va shaffof bo'lguncha 5 daqiqa davomida maydalangan muzga (yoki muzlatgich muzlatgichiga) soling.biroz loyqa) va vaqti-vaqti bilan bir necha marta aralashtiriladi.
D Endotoksinni tozalash vositasi supernatantga qo'shilgach, supernatant loyqa bo'ladi, lekinsupernatant muzli hammomda sovutilgandan so'ng shaffof (yoki biroz loyqa) bo'lishi kerak.
6. Supernatant xona haroratida (>25℃) 10-15 daqiqaga qo'yilgandan so'ng, u loyqa bo'lib qoladi.uning harorati xona haroratiga ko'tariladi.Keyin supernatantni aralashtirish uchun teskari aylantirish kerak.
D xona harorati pastroq bo'lsa yoki siz ekstraksiya vaqtini qisqartirmoqchi bo'lsangiz, supernatantni 37 ~ 42 ℃ suv hammomida 5-10 daqiqa davomida inkubatsiya qilish mumkin va keyingi bosqich supernatandan keyin amalga oshirilishi mumkin.loyqa holga keladi.
7. Fazani ajratish uchun xona haroratida (harorat >25 ℃ bo'lishi kerak) 10 daqiqa davomida taxminan 11 000 rpm (12 000 × g) da supernatantni santrifüj qiling.Yuqori suvli fazada DNK, pastki ko'k yog'li qatlamda endotoksin va boshqa aralashmalar mavjud.ni o'tkazingDNK o'z ichiga olgan suvli faza yangi naychaga vayog'li qatlamni tashlang.
D Santrifüj paytida harorat 25℃ dan yuqori bo'lishi kerak, chunki samarali fazalarni ajratish mumkin emasharorat juda past bo'lsa paydo bo'ladi.
D Fazalarni ajratish samarali bo'lmasa, santrifüj harorati 30 ℃ ga sozlanishi vasantrifugalash vaqti 15 minutgacha oshirilishi mumkin.
D Moviy yog'li qatlamni so'rmang, chunki uning tarkibida endotoksin va boshqa aralashmalar mavjud.
Mexanizm
Qayta suspenziya lizisini neytrallash
◇ 7,5 ml bufer P1 qo'shing
◇ 7,5 ml bufer P2 qo'shing
◇ 7,5 ml bufer P4 qo'shing
Endotoksinni olib tashlash
◇Endotoxin Scavengerning supernatant hajmidan 0, 1 marta qo'shing
Bog'lash va yuvish
◇ 0,5 baravar hajmdagi izopropanol qo'shing
◇ 10 ml Buffer PW qo'shing
◇ 10 ml Buffer PW qo'shing
Elutsiya
◇ 1-2 ml bufer TB yoki endotoksinsiz ddH2O qo'shing
