Hotstart Taq DNK polimeraza
Hot Start Taq DNK polimeraza (antikor modifikatsiyasi) Thermus aquaticus YT-1 dan issiq ishga tushiriladigan termostabil DNK polimeraza bo‘lib, 5'→3' polimeraza faolligi va 5' flapli endonukleaza faolligiga ega.Issiq start Taq DNK polimeraza termolabil Taq antikorlari tomonidan o'zgartirilgan Taq DNK polimerazadir.Antikor modifikatsiyasi PCRning o'ziga xosligini, sezgirligini va rentabelligini oshirdi.
Komponentlar
| Komponent | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5 × HC Taq buferi | 4×1 ml | 4×10 ml | 4×50 ml | 5×400 ml |
| Hot Start Taq DNK polimeraza (antikor modifikatsiyalangan) (5 U/mL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10×5 ml |
Ilovalar
10 mM Tris-HCl (25 ℃ da pH 7,4), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 va 50% Glitserol.
Saqlash holati
0 ° C ostida tashish va -25 ° C ~ -15 ° C haroratda saqlanadi.
Birlik ta'rifi
Bitta birlik 75°C da 30 daqiqada kislotada erimaydigan moddaga 15 nmol dNTP ni birlashtirgan ferment miqdori sifatida aniqlanadi.
Sifat nazorati
1.Endonukleaz faoliyati:20 U fermentni 4 mkg pUC19 DNK bilan 4 soat davomida 37 ℃ da inkubatsiya qilish jel elektroforezi bilan aniqlangan DNKning aniqlanishi mumkin bo'lmagan degradatsiyasiga olib kelmadi.
2.5 kb Lambda PCR:200 mkM dNTP va 0,2 mkM primerlar ishtirokida 1,25 birlik Taq DNK polimeraza bilan 5 ng Lambda DNKning 25 ta PCR kuchaytirilishi kutilgan 5 kb mahsulotga olib keladi.
3.Eksonukleaza faoliyati:10 nmol 5´-FAM oligonükleotid bilan kamida 12,5 U Taq DNK polimerazasini o'z ichiga olgan 50 µl reaktsiyani 37 ℃ da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilish aniqlangan degradatsiyaga olib kelmaydi.
4.RNaz faolligi:20 U fermentni o'z ichiga olgan 10 mL reaktsiyani 1 mkg RNK transkripti bilan 2 soat davomida 37 ° C da inkubatsiya qilish jel elektroforezi bilan aniqlangan RNKning aniqlanishi mumkin bo'lmagan degradatsiyasiga olib kelmadi.
5.Issiqlik inaktivatsiyasi:Yo'q.
Reaktsiya tizimi
| Komponentlar | Ovoz balandligi |
| Shablon DNKa | ixtiyoriy |
| 10 mkM oldinga astar | 0,5 mkl |
| 10 mkM teskari astar | 0,5 mkl |
| dNTP aralashmasi (har biri 10 mM) | 0,5 mkl |
| 5 × HC Taq buferi | 5 mkl |
| Taq DNK polimerazab(5U/mkl) | 0,125 mkl |
| Nukleazsiz suv | 25 mL gacha |
Eslatmalar:
1) a.
| DNK | Miqdori |
| Genomik | 1 ng-1 mkg |
| Plazmid yoki virusli | 1 pg-1 ng |
2) b.Taq DNK polimerazasining optimal kontsentratsiyasi ixtisoslashtirilgan ilovalarda 5-50 birlik/ml (0,1-0,5 birlik/25 mkl reaktsiya) oralig'ida bo'lishi mumkin.
Termal aylanish protokoli
PCR
| Qadam | Harorat(°C) | Vaqt | Velosipedlar |
| Dastlabki denaturatsiyaa | 95 ℃ | 1-3 daqiqa | - |
| Denaturatsiya | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 tsikl |
| Yuvishb | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Kengaytma | 68 ℃ | 1kb/daq | |
| Yakuniy kengaytma | 68 ℃ | 5 daqiqa | - |
Eslatmalar:
1) 95°C da 1 minutlik dastlabki denaturatsiya ko‘pchilik kuchaytirish uchun yetarli.Qiyin shablonlar uchun 95°C da 2-3 daqiqa uzoqroq denaturatsiya qilish tavsiya etiladi.Koloniya PCR bilan 95°C da dastlabki 5 daqiqa denaturatsiya tavsiya etiladi.
2) Yuvish bosqichi odatda 15-60 s.Yuvish harorati primer juftining Tm ga asoslanadi va odatda 45-68 ℃ ni tashkil qiladi.
