mRNK Cap2'-O-metiltransferaza
mRNK Cap 2´ -O-metiltransferaza vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-metiltransferaza genini tashuvchi rekombinant E. coli shtammidan olingan.Bu ferment birinchi nukleotidning 2´-O pozitsiyasiga RNKning 5-uchidagi qopqoq strukturasiga ulashgan metil guruhini qo'shadi. Ferment qopqoqli RNKni (qopqoqni) metillash uchun metil donor sifatida S-adenosilmetionindan (SAM) foydalanadi. -0) natijada cap- 1 strukturasi paydo bo'ladi.
Cap1 strukturasi transfeksiya va mikroinyeksiya tajribalarida mRNKning ifodalanishini yaxshilash orqali translatsiya samaradorligini oshirishi mumkin. Bu ferment substrat sifatida m7GpppN qopqoqli RNKni ayniqsa talab qiladi.U 5´ uchida pN, ppN, pppN yoki GpppN bilan RNK dan foydalana olmaydi.Qopqoqli RNK qopqoq analogidan foydalangan holda in vitro transkripsiyasi yoki Vaccinia yopish fermenti yordamida fermentativ qopqoq orqali tayyorlanishi mumkin.
Komponentlar
mRNK qopqog'i 2´-O-metiltransferaza (50U/mkl)
10 × Qoplama reaktsiyasi buferi
Saqlash
Saqlash uchun -25 ～- 15 ℃ （ Qayta-qayta muzlatish-eritish davrlaridan saqlaning）
Saqlash buferi
20 mM Tris-HCl（pH 8,0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1% Triton X- 100， 50% glitserin.
Birlik ta'rifi
Bitta birlik 37°C da 1 soat ichida 80 nt qopqoqli RNK transkriptining 10 pmolini metillash uchun zarur bo'lgan ferment miqdori sifatida aniqlanadi.
Sifat nazorati tahlillari
Eksonukleaza:50U mRNK Cap 2´ -O-metiltransferaza bilan 1 mkg l-Hind III hazm qilish DNKsi 37 ℃ da 16 soat davomida agaroz gel elektroforezi bilan aniqlanganidek hech qanday degradatsiyaga olib kelmaydi.
Endonukleaz: 50 U mRNK Qopqoq 2´ -O-Metiltransferaza 1 mkg lDNK bilan 37℃ da 16 soat davomida agaroz gel elektroforezi bilan aniqlanganidek hech qanday degradatsiyaga olib kelmaydi.
Nikase: 50U mRNK Cap 2´ -O-metiltransferaza bilan 1 mkg pBR322 bilan 37 ℃ da 16 soat davomida agaroz gel elektroforezi bilan aniqlanganidek hech qanday degradatsiyaga olib kelmaydi.
RNase: 50U mRNK Cap 2´ -O-metiltransferaza bilan 1,6 mkg MS2 RNK bilan 37 ℃ da 4 soat davomida agaroz gel elektroforezi bilan aniqlanganidek hech qanday degradatsiyaga olib kelmaydi.
E. coli DNK: 50U mRNK Cap 2´ -O-metiltransferaza borligi uchun tekshiriladi.E. coli uchun xos primerlar bilan TaqMan qPCR yordamida genomik DNKE. coli 16S rRNK joylashuvi.TheE. coli DNKning genomik ifloslanishi =1E. coli genom.
Bakterial Endotoksin: LAL-test, Xitoy Farmakopeyasi IV 2020 nashriga ko'ra, jel chegarasi sinov usuli, umumiy qoida (1143).Bakterial endotoksin miqdori =10 EU/mg bo'lishi kerak.
Reaktsiya tizimi va shartlari
1. Qopqoqli RNK va RNazsiz H2O ning tegishli miqdorini 1,5 ml mikrofuga trubkasiga 16,0 mkL yakuniy hajmgacha birlashtiring.
2. 65℃ haroratda 5 daqiqa qizdiring, so'ngra 5 daqiqa davomida muzli hammom qiling.
3. Belgilangan tartibda quyidagi komponentlarni qo'shing (Qopqoqli RNK metilatsiyasi uchun
10 dan kam
| Komponent | Ovoz balandligi |
| Denaturlangan qopqoqli RNK | 16 mkl |
| 10X yopish reaksiyasi buferi* | 2 mL |
| SAM (4 mM) | 1 mkl |
| mRNK qopqog'i 2´-O-metiltransferaza (50 U/mL) | 1 mkl |
| ddH2O | 20 mL gacha |
*10× Qoplama reaksiyasi buferi: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT.
4. 37℃ da 1 soat davomida inkubatsiya qiling (200 nt dan kam maqsadli fragment uchun 2 soat inkubatsiya tavsiya etiladi).
Ilovalar
Mikroin'ektsiya va transfeksiya tajribalarida mRNK ifodasini yaxshilash.
Foydalanish bo'yicha eslatmalar
1. Reaksiyadan oldin RNKni tozalash va nukleazsiz suvda eritish kerak, barcha eritmalarda EDTA va ionlar bo'lmasligi kerak.
2. Transkriptning 5-uchidagi ikkilamchi tuzilmani olib tashlash uchun reaksiya boshlanishidan 5 minut oldin namunadagi RNKni 65 ℃ haroratda qizdirish tavsiya etiladi.Murakkab 5´-terminal tuzilishi uchun uni 10 daqiqagacha uzaytirish mumkin.
