Rnase inhibitori
Murin RNase inhibitori E.coli dan ifodalangan va tozalangan rekombinant sichqon RNaz inhibitori.U RNase A, B yoki C bilan 1:1 nisbatda kovalent bo'lmagan bog'lanish orqali bog'lanadi va shu bilan uchta fermentning faolligini inhibe qiladi va RNKni parchalanishdan himoya qiladi.Biroq, u RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H yoki RNase Aspergillusga qarshi samarali emas.Murin RNase inhibitori RT-PCR, RT-qPCR va IVT mRNK tomonidan sinovdan o'tkazildi va turli xil tijorat teskari transkriptazalar, DNK polimerazalar va RNK polimerazalari bilan mos edi.
Inson RNase ingibitorlari bilan solishtirganda, sichqoncha RNase inhibitori oksidlanishga juda sezgir bo'lgan ikkita sisteinni o'z ichiga olmaydi, bu inhibitorning inaktivatsiyasiga olib keladi.Bu uni DTT ning past konsentratsiyasida (1 mM dan kam) barqaror qiladi.Bu xususiyat uni DTT ning yuqori konsentratsiyasi reaktsiyaga salbiy ta'sir ko'rsatadigan reaktsiyalarda foydalanish uchun mos qiladi (masalan, Real-time RT-PCR).
Ailova
Ushbu mahsulot RNK degradatsiyasini oldini olish uchun RNaz aralashuvi mumkin bo'lgan har qanday tajribada keng qo'llanilishi mumkin, masalan:
1.cDNK ning birinchi zanjiri sintezi, RT-PCR, RT-qPCR va boshqalar.
2.In vitro transkripsiya/translyatsiya paytida RNKni degradatsiyadan himoya qiladi (masalan, in vitro virusli replikatsiya tizimi).
3.RNKni ajratish va tozalash jarayonida RNaz faolligini inhibe qilish.
Saqlash shartlari
Mahsulot -25～-15 ℃ haroratda saqlanishi mumkin, amal qilish muddati 2 yil.
Saqlash buferi
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT va 50% glitserin.
Birlik ta'rifi
5ng ribonukleaza A faolligini 50% ga inhibe qilish uchun zarur bo'lgan sichqon RNase inhibitori miqdori bir birlik (U) sifatida belgilangan.
Proteinning molekulyar og'irligi
Sichqoncha RNase inhibitorining molekulyar og'irligi 50 kDa ni tashkil qiladi.
Sifat nazorati
Eksonukleaza Faoliyat:
40 U sichqoncha RNase inhibitori, 1 mkg l -Hind III hazm qilish DNKsi bilan 37 ℃ da 16 soat davomida agaroz gel elektroforezi bilan aniqlanganidek, hech qanday degradatsiyaga olib kelmaydi.
Endonukleaz faolligi:
16 soat davomida 37 ℃ da 1 m g l DNK bilan 40 U sichqon RNase inhibitori agaroz gel elektroforezi bilan aniqlanganidek hech qanday degradatsiyaga olib kelmaydi.
Nicking Faoliyat:
16 soat davomida 37 ℃ haroratda 1 mkg pBR322 bilan 40U sichqoncha RNase inhibitori agaroz gel elektroforezi bilan aniqlanganidek hech qanday degradatsiyaga olib kelmaydi.
RNase Faoliyat:
37 ℃ da 4 soat davomida 1,6 mkg MS2 RNK bilan 40U sichqoncha RNase inhibitori agaroz gel elektroforezi bilan aniqlanganidek hech qanday degradatsiyaga olib kelmaydi.
E.coli DNKsi:
40 U sichqoncha RNase inhibitori E. coli 16S rRNK lokusuga xos primerlar bilan TaqMan qPCR yordamida E. coli genomik DNKsi mavjudligi uchun tekshiriladi.E. coli genomik DNK ifloslanishi ≤ 0,1 pg/40 U.
Notes
1.Kuchli tebranish yoki aralashtirish fermentning inaktivatsiyasiga olib keladi.
2. Ushbu inhibitorning optimal harorat diapazoni 25-55 ℃ edi va 65 ℃ va undan yuqori haroratda faolsizlantirildi.
3.RNase H, RNase 1 va RNase T1 ning faoliyati sichqoncha RNase inhibitori tomonidan inhibe qilinmagan.
4.RNaz faolligining inhibisyonu pH ning keng diapazonida (pH 5-9 barcha faol edi) topildi va eng yuqori faollik pH 7-8 da kuzatildi.
5. Ribonukleazlar odatda denaturatsiya sharoitida faollikni saqlab qolganligi sababli, ribonukleaza bilan komplekslashgan RNaz inhibitori molekulalarini denaturatsiya qilishdan ehtiyot bo'lish kerak.Faol ribonukleaza chiqarilishini oldini olish uchun 50 °C dan yuqori harorat va karbamid yoki boshqa denaturatsiya qiluvchi moddalarning yuqori konsentratsiyasidan qochish kerak.
