Vaccinia virusini yopish fermenti

Vaccinia virusini yopish fermenti rekombinant E. coli shtammidan olingan bo'lib, Vaccinia yopish fermenti uchun genlarni olib yuradi.Bu yagona ferment ikkita subbirlikdan (D1 va D12) tashkil topgan va uchta fermentativ faollikka ega (D1 subbirligi tomonidan RNK trifosfataza va guanililtransferaza va D12 subbirligi tomonidan guanin metiltransferaza).Vaccinia virusini yopish fermenti qopqoq strukturasining shakllanishini katalizlash uchun samarali bo'lib, u 7-metilguanilat qopqoq strukturasini (m7Gppp, Cap 0) RNKning 5' uchiga maxsus biriktirishi mumkin.Qopqoq tuzilishi (Qopqoq 0) eukariotlarda mRNKni barqarorlashtirish, tashish va tarjima qilishda muhim rol o'ynaydi.RNKni enzimatik reaktsiya bilan qoplash samarali va oddiy usul bo'lib, u in vitro transkripsiya, transfeksiya va mikroin'ektsiya uchun RNKning barqarorligi va tarjimasini sezilarli darajada yaxshilaydi.

Komponentlar

Vaccinia virusini yopish fermenti (10 U/mkl)

10 × Qoplama buferi

Saqlash shartlari

Saqlash uchun -25～- 15℃ （ Qayta-qayta muzlatish-eritish davrlaridan saqlaning）

Saqlash buferi

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1% Triton X- 100, 50% glitserin.

Birlik ta'rifi

Vaccinia virusini yopish fermentining bir birligi 10pmol GTP ni 37°C da 1 soat ichida 80nt transkriptga kiritish uchun zarur bo'lgan ferment miqdori sifatida aniqlanadi.

Sifat nazorati

Eksonukleaza:1 mg l-Hind III hazm bo'ladigan DNKli 10U Vaccinia virusi qoplovchi fermenti 37 ℃ haroratda 16 soat davomida agaroz gel elektroforezi bilan aniqlanganidek hech qanday degradatsiyaga olib kelmaydi.

Endonukleaz:16 soat davomida 37 ℃ haroratda 1 mkg lDNKli 10U Vaccinia virusini yopish fermenti agaroz gel elektroforezi bilan aniqlanganidek, hech qanday degradatsiyaga olib kelmaydi.

Nikase:1 mkg pBR322 bilan 37 ℃ haroratda 16 soat davomida Vaccinia virusini yopish fermenti 10U agaroz gel elektroforezi bilan aniqlanganidek, hech qanday degradatsiyaga olib kelmaydi.

RNase:37 ℃ haroratda 4 soat davomida 1,6 mkg MS2 RNK bilan 10U Vaccinia virusini yopish fermenti agaroz gel elektroforezi bilan aniqlanganidek hech qanday degradatsiyaga olib kelmaydi.

1.coli DNKsi:10U Vaccinia virusini yopish fermenti E. coli 16S rRNK lokusuga xos primerlar bilan TaqMan qPCR yordamida E. coli genomik DNKsi mavjudligi uchun tekshiriladi.E. coli genomik DNK ifloslanishi ≤1 E. coli genomidir.

2.Bakterial Endotoksin: LAL-test, Xitoy Farmakopeyasi IV 2020 nashriga ko'ra, jel chegarasi sinov usuli, umumiy qoida (1143).Bakterial endotoksin miqdori ≤10 EU/mg bo'lishi kerak.

Reaktsiya tizimi va shartlari

1. Qoplash protokoli (reaktsiya hajmi: 20 mkl)

Ushbu protsedura 10 mkg RNK (≥100 nt) ni yopish reaksiyasiga taalluqlidir va uni eksperimental talablarga muvofiq oshirish mumkin.

I) 10 mkg RNK va nukleazsiz H2O ni 1,5 ml mikrofuga trubkasida 15,0 mkl yakuniy hajmgacha birlashtiring.*10×Qoplama buferi: 0,5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) 5 daqiqa davomida 65 ℃ haroratda qizdiring, keyin 5 daqiqa davomida muzli hammom qiling.

3) Belgilangan tartibda quyidagi komponentlarni qo'shing

*10×Qoplama buferi: 0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8,0)

4) 37°C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling, endi RNK yopilgan va quyi oqimdagi ilovalarga tayyor.

2. 5′ terminali markalash reaktsiyasi (reaktsiya hajmi: 20 mL)

Ushbu protokol 5´ trifosfatni o'z ichiga olgan RNKni belgilash uchun mo'ljallangan va uni talablarga muvofiq kattalashtirish mumkin.Yorliqlarni kiritish samaradorligiga RNK ning molyar nisbati: GTP, shuningdek, RNK namunalaridagi GTP tarkibi ta'sir qiladi.

1) 1,5 ml li mikrofuga trubkasida kerakli miqdordagi RNK va nukleazsiz H2O ni yakuniy hajmi 14,0 mklgacha birlashtiring.

2) 5 daqiqa davomida 65 ℃ haroratda qizdiring, keyin 5 daqiqa davomida muzli hammom qiling.

3) Belgilangan tartibda quyidagi komponentlarni qo'shing.

** GTP MIX GTP va oz sonli markerlarga ishora qiladi.GTP kontsentratsiyasi uchun qarangEslatma 3 ga.

4) 37°C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling, RNK 5′ uchi endi etiketlangan va quyi oqimga tayyor.

Ilovalar

1. Tarjima tahlillari/in vitro tarjimasi oldidan mRNKni yopish

2. mRNKning 5´ uchini belgilash

Foydalanish bo'yicha eslatmalar

1.RNK eritmasini inkubatsiyadan oldin Vaccinia Capping Enzyme bilan qizdirish transkriptning 5-uchidagi ikkilamchi tuzilmani olib tashlaydi.Ma'lum yuqori tuzilgan 5´uchlari bo'lgan transkriptlar uchun vaqtni 60 daqiqagacha uzaytiring.

2. Reaksiyalarni yopish uchun ishlatiladigan RNK ishlatishdan oldin tozalanishi va nukleazsiz suvda to'xtatilishi kerak.EDTA mavjud bo'lmasligi kerak va eritma tuzlardan xoli bo'lishi kerak.

3. 5´ uchini belgilash uchun umumiy GTP kontsentratsiyasi reaksiyadagi mRNKning molyar konsentratsiyasidan 1-3 baravar ko'p bo'lishi kerak.

4. Reaksiya tizimining hajmi haqiqiyga ko'ra kattalashishi yoki kamayishi mumkin.