Ikki zanjirli RNK (dsRNK) ELISA KIT

Ushbu to'plam biotin-Streptavidin tizimi bilan ferment bilan bog'langan immunosorbent tahlili (ELISA) birikmasi bo'lib, ketma-ketligidan qat'i nazar, uzunligi 60 ta asosiy juftdan (bp) yuqori bo'lgan dsRNKni miqdoriy o'lchash uchun mo'ljallangan.Plastinka anti-dsRNK antikori bilan oldindan qoplangan.Namunada mavjud bo'lgan dsRNK qo'shiladi va quduqlar bilan qoplangan antikorlarga bog'lanadi.Keyin biotinlangan anti-dsRNK antikor qo'shiladi va namunadagi dsRNK bilan bog'lanadi.Yuvishdan so'ng HRP-Streptavidin qo'shiladi va biotinlangan anti-dsRNK antikoriga bog'lanadi.Inkubatsiyadan so'ng bog'lanmagan HRP-Streptavidin yuviladi.Keyin TMB substrat eritmasi qo'shiladi va HRP tomonidan katalizlanadi va kislotali to'xtash eritmasi qo'shilgandan keyin sariq rangga o'zgargan ko'k rangli mahsulot hosil bo'ladi.Sariqning zichligi plastinkada olingan dsRNKning maqsadli miqdoriga mutanosibdir.Absorbans 450 nm da o'lchanadi.

Ilova

Ushbu to'plam qoldiq dsRNKni miqdoriy o'lchash uchun mo'ljallangan.

To'plam komponentlari

Saqlash va barqarorlik

1. Ishlatilmagan to'plam uchun: butun to'plamni saqlash muddati davomida 2 ~ 8 ℃ haroratda saqlash mumkin.Saqlash barqarorligi uchun kuchli yorug'likdan qochish kerak.

2. Ishlatilgan to'plam uchun: Mikroplastinka ochilgandan so'ng, ishlatilmagan quduqlarni plastinka yopishtiruvchi bilan yoping va qurituvchi paketi bo'lgan folga qopiga qayting, folga qopchasini mahkam yoping va foydalanishdan keyin imkon qadar tezroq 2 ~ 8 ℃ haroratga qayting.Boshqa reagentlar foydalanishdan keyin imkon qadar tezroq 2 ~ 8 ℃ ga qaytarilishi kerak.

Kerakli, lekin taqdim etilmagan materiallar

1. 450±10nm filtrli mikroplastinka o'quvchi (agar 450 va 650 nm to'lqin uzunligida aniqlay olsa yaxshi).

2. Mikroplastinkalarni silkituvchi.

3. RNazsiz uchlari va santrifuga naychalari.

Operatsion sxema

Boshlashdan oldin

1. Ishlatishdan oldin to'plamning barcha komponentlari va namunalarini xona haroratiga (18-25 ℃) keltiring.Agar to'plam bir vaqtning o'zida ishlatilmasa, iltimos, hozirgi tajriba uchun faqat chiziqlar va reagentlarni oling va qolgan chiziqlar va reagentlarni kerakli holatda qoldiring.

2. Yuvish buferi: 800 ml 1 × yuvish buferini tayyorlash uchun 40 ml 20 × konsentrlangan yuvish buferini 760 ml deionizatsiyalangan yoki distillangan suv bilan suyultiring.

3. Standart: foydalanishdan oldin eritmani qisqa vaqt davomida aylantiring yoki santrifüj qiling.Taqdim etilgan to'rtta standartning kontsentratsiyasi 5ng/mkl.UTP va pUTP dsRNA standartlari uchun standart egri chiziqni chizish uchun eritmani STE buferi bilan 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0pg/mL gacha suyultiring.N1-Me-pUTP dsRNA standartlari uchun standart egri chiziqni chizish uchun eritmani STE buferi bilan 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/mL gacha suyultiring.5-OMe-UTP dsRNA standarti uchun standart egri chiziqni chizish uchun eritmani STE buferi bilan 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/mL gacha suyultiring.Standartlarni quyidagi diagrammalar shaklida suyultirishni tavsiya qilamiz:

4. Biotinillangan aniqlovchi antikor va HRP-streptavidin ishchi eritmasi: foydalanishdan oldin stok eritmasini qisqa vaqt davomida aylantiring yoki santrifüj qiling.Ularni suyultiruvchi bufer bilan ish konsentratsiyasigacha suyultiring.

5. TMB substate: sterillangan uchlari bilan eritmaning kerakli dozasini aspiratsiya qiling va qoldiq eritmani yana flakonga tashlamang.TMB pastki holati yorug'likka sezgir, TMB substratiga uzoq vaqt davomida nur ta'sir qilmang.

Protokoldan foydalanish

1. Tahlil uchun zarur bo'lgan chiziqlar sonini aniqlang.Foydalanish uchun chiziqlarni ramkalarga joylashtiring.Ushbu tahlilda ishlatilmagan qolgan plastinka chiziqlari qurituvchi bilan qopga qayta o'ralishi kerak.Sovutgichda saqlash uchun sumkani mahkam yoping.

2. Tegishli quduqlarga standart, blanka va namunalarning har bir suyultirilishidan 100 mkl qo'shing.Plastinka yopishtiruvchi bilan yoping.Xona haroratida 1 soat davomida 500 rpm tezlikda silkitib inkubatsiya qiling.Namunalar aniq tahlil qilish uchun tegishli konsentratsiyaga qadar STE buferi bilan suyultirilishi kerak.

3. Yuvish bosqichi: eritmani aspiratsiya qiling va har bir quduqqa 250 mkl yuvish buferi bilan yuving va 30 soniya davomida turing.Plastinani changni yutish qog'ozga yopishtirish orqali yuvish buferini butunlay tashlang.To'liq 4 marta yuving.

4. Har bir quduqqa 100 mkl biotinillangan aniqlovchi antikor ishlaydigan eritma qo'shing.Plastinka yopishtiruvchi bilan yoping.Xona haroratida 1 soat davomida 500 rpm tezlikda silkitib inkubatsiya qiling.

5. Yuvish bosqichini takrorlang.

6. Har bir quduqqa 100 mkl HRP-streptavidin ishchi eritmasini qo'shing.Plastinka yopishtiruvchi bilan yoping.Xona haroratida 30 daqiqa davomida 500 rpm tezlikda silkitib inkubatsiya qiling.

7. Yuvish bosqichini yana takrorlang.

8. Har bir quduqqa 100 mkl TMB substrat eritmasini qo'shing.Plastinka yopishtiruvchi bilan yoping.RT da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling Yorug'likdan saqlang.Substrat eritmasi qo'shilishi bilan suyuqlik ko'k rangga aylanadi.

9. Har bir quduqqa 50 mkl to'xtatuvchi eritma qo'shing.Suyuqlik to'xtash eritmasi qo'shilishi bilan sarg'ayadi.Keyin mikroplata o'quvchini ishga tushiring va darhol 450 nm da o'lchov o'tkazing.

Natijalarni hisoblash

1. Har bir standart, nazorat va namunalar uchun takroriy ko'rsatkichlarni o'rtacha hisoblang va o'rtacha nol standart optik zichlikni ayiring.Vertikal (Y) o'qda absorbsiya va gorizontal (X） o'qda dsRNK kontsentratsiyasi bilan standart egri chiziqni tuzing.

2. Hisoblashni 5 yoki 4 parametrli chiziqli bo'lmagan mos modelda egri chiziqli ekspert 1.3 yoki ELISA Calc kabi kompyuterga asoslangan egri chiziqni o'rnatish dasturi bilan bajarish tavsiya etiladi.

Ishlash

1. Sezuvchanlik:

aniqlashning pastki chegarasi: ≤ 0,001pg/mkL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA uchun), ≤ 0,01pg/mkL (5-OMe-UTP-dsRNA uchun).

miqdorning pastki chegarasi: 0,0156 pg/mkl (UTP-, pUTP-dsRNA uchun), 0,0312 pg/mkL (N1-Me-pUTP-dsRNA uchun), 0,0625 pg/mkL (5-OMe-UTP-dsRNA uchun).

2. Aniqlik: Intra-assay CV ≤10%, Inter-assay CV ≤10%

3. Qayta tiklash: 80% ~ 120%

4.Chiziqlik: 0,0156-0,5pg/mkL(UTP-,pUTP-dsRNA uchun)0,0312-1pg/mkl (N1-Me-pUTP dsRNA uchun),0,0625-1pg/mkL (5-OMe-UTP-dsRNA uchun).

Mulohazalar

1. TMB reaktsiya harorati va vaqti juda muhim, iltimos, ularni ko'rsatmalarga muvofiq qat'iy nazorat qiling.

2. Tahlilning yaxshi takrorlanishi va sezgirligiga erishish uchun ortiqcha reaksiyaga kirmagan reagentlarni olib tashlash uchun plitalarni to'g'ri yuvish zarur.

3. Ishlatishdan oldin barcha reagentlar yaxshilab aralashtirilishi kerak va namuna yoki reagentlar qo'shilganda pufakchalar paydo bo'lishiga yo'l qo'ymaslik kerak.

4. Agar konsentrlangan yuvish buferida (20x) kristallar hosil bo'lsa, 37 ℃ ga qizdiring va kristallar to'liq eriguncha sekin aralashtiring.

5. Natriy azid (NaN3) bo'lgan namunalarni tahlil qilishdan saqlaning, chunki u HRP faolligini buzishi va dsRNK miqdorining kam baholanishiga olib kelishi mumkin.

6. Tahlil paytida RNase kontaminatsiyasidan saqlaning.

7. Standart/namuna, aniqlovchi antikor va SA-HRP RT da silkitmasdan ham o'tkazilishi mumkin, ammo bu aniqlash sezuvchanligini bir barobarga pasayishiga olib kelishi mumkin.Bunday holda, biz UTP va pUTP dsRNA standartlarini 2pg/mkl dan suyultirishni tavsiya qilamiz, N1-Me-pUTP dsRNA standartlarini 4pg/mkl dan va 5-OMe-UTP dsRNA standartini 8pg/mkl dan suyultirish kerak.Bundan tashqari, HRP-streptavidin ishchi eritmasini xona haroratida 60 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.Kolbani silkitgichdan foydalanmang, chunki kolba chayqatish noto'g'ri natijaga olib kelishi mumkin.

Oddiy natija

1. Standart egri chiziq ma'lumotlari

2. Standart egri chiziqni hisoblash

3. Laynerni aniqlash diapazoni: 0,0312- 1pg/mkL