O'simlik uchun to'g'ridan-to'g'ri PCR to'plami
Mushuk raqami: HCR2020A
O'simlik to'g'ridan-to'g'ri PCR to'plami o'simlik barglari, urug'lari va boshqalarni to'g'ridan-to'g'ri kuchaytirish uchun javob beradi va polisakkaridlar va polifenollarni o'z ichiga olmaydigan o'simlik namunalarini yuqori o'tkazuvchanlik bilan tekshirish uchun ishlatilishi mumkin.Yo'naltirilgan evolyutsiyaga asoslangan to'g'ridan-to'g'ri kuchaytiruvchi DNK polimeraza o'simliklardagi PCR inhibitörlerine nisbatan yuqori bardoshlik xususiyatiga ega.Shu bilan birga, u 5 kb ichida DNK fragmentlarini kuchaytirish uchun mos bo'lgan yuqori kuchaytirish ko'rsatkichlarini saqlaydi.To'plamdagi noyob Lizis buferi A yangi yoki muzlatilgan o'simlik to'qimalarini lizislash uchun ishlatilishi mumkin.Ishlash oson va lizat tozalashsiz kuchaytirish uchun shablon sifatida ishlatilishi mumkin.Tizimda xom namunalarni qayta-qayta muzlatish va eritishdan keyin samarali kuchaytirish imkonini beruvchi himoya vositalari mavjud.2 × Plant Direct Master Mix faqat kuchaytirish reaktsiyasini amalga oshirish uchun primerlar va shablonlarni qo'shishi kerak, bu esa pipetleme operatsiyalarini kamaytiradi va aniqlash o'tkazuvchanligini va natijalarning takrorlanishini yaxshilaydi.
Komponentlar
| Komponentlar | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Zavodning bevosita asosiy aralashmasi | 1,25 ml | 4×1,25 ml |
| O'simlikning to'g'ridan-to'g'ri lizis buferi A | 5 ml | 20 ml |
| O'simlik to'g'ridan-to'g'ri lizis buferi B* | 5 ml | 20 ml |
*O'simlikning to'g'ridan-to'g'ri lizis buferi B ixtiyoriy reagent bo'lib, namunalarni saqlash vaqtini uzaytirish uchun o'simlikning to'g'ridan-to'g'ri lizis buferi A ni zararsizlantirish uchun ishlatiladi.U haqiqiy vaziyatga qarab ishlatilishi mumkin.
Saqlash shartlari
2 × Plant Direct Master Mix, -30 ~ -15 ℃ haroratda saqlang va takroriy muzlatish va eritishdan saqlaning;O'simlik to'g'ridan-to'g'ri liziz buferi, -30 ~ -15 ℃ yoki 2 ~ 8 ℃ da saqlang.
Tajriba jarayoni
Namunalarni qayta ishlash-O'simlik bargi
To'g'ridan-to'g'ri usul:Yosh barglardan foydalanish tavsiya etiladi.Kichkina va bir xil namunani olish uchun 0,5-3 mm qattiq diametrli teshikdan foydalaning va keyin namunani to'g'ridan-to'g'ri PCR tizimiga qo'shing (50 mkl tizimi tavsiya etiladi).E'tibor bering, namuna trubka devoriga emas, balki PCR eritmasida ekanligiga ishonch hosil qiling.Agar to'g'ridan-to'g'ri PCR uzun bo'laklarni va murakkab namunalarni kuchaytirish uchun ishlatilsa, shablon sifatida kichikroq diametrli (0,5 - 1 mm) namunadan foydalanish yaxshi natijalarga erishishga yordam beradi.
Lizisni maydalash usuli:Yosh barglardan foydalanish tavsiya etiladi.Bargning kichik bir bo'lagini (diametri taxminan 1-3 mm) oling, uni 20 mkl Plant Direct Lysis Buffer Ab ichiga joylashtiring va iloji boricha maydalang (bu qadam bargni 100 mkl pipetka uchi bilan siqish orqali amalga oshirilishi mumkin. namunani maydalash uchun).Agar barg to'qimalarining kattaroq hajmlari ishlatilsa (7 mm dan oshmasligi kerak), suyultiruvchi bufer hajmini 50 mkl gacha oshiring.Barglar maydalangandan so'ng, eritma yashil ko'rinishi kerak.Qisqa santrifüjdan so'ng, 1 mkl supernatantni PCR tizimiga reaktsiya shabloni sifatida qo'shing.
Termal liziz usuli:Yosh barglardan foydalanish tavsiya etiladi.Bargning kichik bir bo'lagini (diametri taxminan 1-3 mm) oling, uni 20 mkl O'simlik to'g'ridan-to'g'ri lizis A tamponiga joylashtiring va 5-10 daqiqa davomida 95 ° C da qizdiring.Lizis vaqti lizislash qiyin bo'lgan barglar uchun mos ravishda uzaytirilishi mumkin (20 daqiqadan ko'p bo'lmagan).Agar barg to'qimalarining kattaroq hajmlari ishlatilsa (7 mm dan oshmasligi kerak), suyultiruvchi bufer hajmini 50 mkl gacha oshiring.Isitgandan so'ng, qisqa vaqt davomida santrifüj qiling va PCR tizimiga reaktsiya shablonlari sifatida 1 mkl supernatant qo'shing.
Namunalarni qayta ishlash- O'simlik urug'i
Lizisni maydalash usuli:5 mm diametrli urug'larni kesish uchun skalpeldan foydalaning, ularni 100 mkl Plant Direct Lysis Buffer A ga qo'shing va namunani pipetka uchi yoki boshqa asboblar bilan maydalang.Qisqacha aylantiring va xona haroratida 3-5 daqiqaga qoldiring.Urug' namunasi suyultirish buferiga botganligiga ishonch hosil qiling.Qisqa santrifüjdan so'ng, reaktsiya shablonlari sifatida PCR tizimiga 1 mkl supernatant qo'shing.
Termal liziz usuli:5 mm diametrli urug'larni kesish uchun skalpeldan foydalaning, ularni 100 mkl Plant Direct Lysis Bufer A qo'shing va 95 ° C da 5 - 10 daqiqa davomida qizdiring.Lizis vaqti lizislash qiyin bo'lgan barglar uchun mos ravishda uzaytirilishi mumkin (30 daqiqadan ko'p bo'lmagan).Isitgandan so'ng, qisqa vaqt davomida santrifüj qiling va PCR tizimiga reaktsiya shablonlari sifatida 1 mkl supernatant qo'shing.
a.Kerakli o'lchamdagi namunalarni kesish uchun qaychi yoki boshqa asboblar ham ishlatilishi mumkin;agar zımba yoki qaychi qayta ishlatilsa, namunalar orasidagi o'zaro kontaminatsiyani oldini olish uchun har foydalanishdan oldin ular 2% natriy gipoxlorit eritmasi bilan tozalanishi kerak.
b.Ishlatishdan oldin Plant Direct Lysis Buferi to'liq eritilganligiga ishonch hosil qiling.Agar tampon yopishqoq bo'lsa yoki cho'kma bo'lsa, uni ishlatishdan oldin uni to'liq eritish uchun 37 ℃ da qizdirish mumkin.
c.Reaksiya tizimidagi shablon hajmi o'simlik moddasi va qo'shilgan suyultiruvchi hajmidagi farqga qarab mos ravishda sozlanishi mumkin.
O'simlik to'g'ridan-to'g'ri liziz buferi
Ushbu mahsulot tarkibidagi o'simlik to'g'ridan-to'g'ri liziz buferi A ko'pgina o'simlik to'qimalarining genomini chiqarish uchun qat'iy optimallashtirilgan va xom o'simliklarni 4 ℃ haroratda qisqa muddatli saqlash uchun javob beradi.Agar namunani uzoqroq vaqt davomida (masalan, 1-2 oy) saqlash kerak bo'lsa, supernatantni yangi EP trubasiga o'tkazish va uni -20 ℃ haroratda saqlash tavsiya etiladi.Namunalarni barqarorroq saqlash uchun o'tkazilgan supernatantga teng hajmdagi Plant Direct Lysis Bufer B qo'shing, yaxshilab aralashtiring va -20 ℃ da saqlang.Barqaror saqlash muddati o'simlik namunalari va holatlariga qarab farq qiladi.
Reaktsiya tizimi
| ddH2O | 20,0 mkl gacha | 50,0 mkl gacha |
| 2 × Zavodning bevosita asosiy aralashmasia | 10,0 mkl | 25,0 mk |
| Primer 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 mkl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 mkl |
| O'simlik barglari / xom ekstrakti namunasi(Namunani qayta ishlashga qarang) | 0,5 – 3 mm barg disk/x mkl | 0,5 – 3 mm barg disk/x mkl |
a.U tarkibida Mg mavjud2+2 mM yakuniy konsentratsiyada.
b.Har bir primer uchun 0,4 mkM yakuniy konsentratsiyadan foydalanish tavsiya etiladi.Primerlarni haddan tashqari ishlatish nonspesifik kuchaytirilishiga olib keladi.
c.Amaldagi namuna miqdori haqiqiy vaziyatga qarab sozlanishi mumkin.Xom lizislangan namunaning bitta reaktsiyasida ishlatiladigan miqdor reaktsiyaning umumiy hajmining 2% dan 20% gacha sozlanishi mumkin.Haddan tashqari ko'p namunalardan foydalanish kuchaytirgichning ishlamay qolishiga olib kelishi mumkin.
Reaksiya dasturi
| Qadamlar | Harorat | Vaqt |
| Dastlabki denaturatsiya | 98℃ | 5 min |
| Denaturatsiya | 95℃ | 10 sek |
| Yuvish | 58 ~ 72 ℃ | 15 sek |
| Kengaytma | 72℃ | 30 sek |
| Yakuniy kengaytma | 72℃ | 5 min |
a.Dastlabki denaturatsiya (98 ℃, 5 min) o'simlik to'qimalarining lizisini rag'batlantiradi, PCR amplifikatsiyasi uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan genomik DNKni chiqaradi.Vaqtni qisqartirmang yoki haroratni pasaytirmang.
b.Uni primer Tm qiymatiga teng yoki Tm qiymatidan 2 ~ 4 ℃ yuqoriroq o'rnatish tavsiya etiladi.Ushbu mahsulotda ishlatiladigan to'g'ridan-to'g'ri kuchaytiruvchi DNK polimeraza an'anaviy Taq DNK polimerazasidan farq qiladi va reaktsiyani yumshatish harorati uchun maxsus talablarga ega; yuqori tavlanish haroratidan foydalanish o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirishni samarali ravishda kamaytirishi va kuchaytirish samaradorligini oshirishi mumkin.Murakkab shablonlar uchun tavlanish haroratini sozlash va uzaytirish vaqtini uzaytirish orqali samarali kuchaytirishga erishish mumkin.
c.Agar kuchaytirish mahsulotining uzunligi ≤1 kb bo'lsa, uzaytirish vaqti 30 sek / kb ga o'rnatiladi;agar kuchaytirish mahsulotining uzunligi > 1 kb bo'lsa, uzaytirish vaqti 60 sek / kb ga o'rnatiladi.
d.Murakkab namunalar yoki amplifikatsiya rentabelligi past bo'lgan namunalar uchun tsikllar soni mos ravishda 40-50 tsiklgacha oshirilishi mumkin.
Ilovalar
U o'simlik to'qimalarini to'g'ridan-to'g'ri kuchaytirish va polisakkaridlar va polifenollarni o'z ichiga olmaydigan o'simlik namunalarini yuqori o'tkazuvchanlik bilan tekshirish uchun qo'llaniladi.
Eslatmalar
Faqat tadqiqot uchun.Diagnostika muolajalarida foydalanish uchun emas.
1. Xom o'simliklarni kuchaytirish yoki to'g'ridan-to'g'ri kuchaytirish uchun tizim, primerlar va operatsiyalarning to'g'riligini ta'minlash uchun tajribani boshlashdan oldin musbat nazorat sifatida tozalangan genomik DNKdan foydalanish tavsiya etiladi.
2. Ushbu to'plamda ishlatiladigan to'g'ridan-to'g'ri kuchaytiruvchi DNK polimeraza kuchli tekshirish faolligiga ega.Agar TA klonlashni amalga oshirish kerak bo'lsa, adeninni qo'shishdan oldin DNKni tozalash tavsiya etiladi.
3. Primer dizayni bo'yicha ko'rsatmalar:
a.Astarning 3' uchidagi oxirgi taglik G yoki C bo'lishi tavsiya etiladi.
b.Primerning 3' uchida oxirgi 8 ta asosda ketma-ket mos kelmaslik kerak.c.Astarning 3' uchida soch turmagi tuzilmalaridan saqlaning.
d.Oldinga va teskari primerning Tm qiymatidagi farqlar 1℃ dan oshmasligi kerak va Tm qiymati 60 ~ 72 ℃ ga sozlanishi kerak (Tm qiymatini hisoblash uchun Primer Premier 5 tavsiya etiladi).
e.Astar Tm qiymatini hisoblashda shablonga mos kelmaydigan qo'shimcha qo'shimcha primer ketma-ketliklari kiritilmasligi kerak.
f.Astarning GC tarkibi 40% -60% bo'lishi tavsiya etiladi.
g.Primerda A, G, C va T ning umumiy taqsimoti imkon qadar teng bo'lishi kerak.GC yoki AT miqdori yuqori boʻlgan hududlardan foydalanishdan saqlaning.
h.Primer ichida yoki ikkita astar o'rtasida 5 yoki undan ortiq asoslarning qo'shimcha ketma-ketliklari mavjudligidan saqlaning va ikkita primerning 3' uchida 3 yoki undan ortiq asoslarning qo'shimcha ketma-ketliklari mavjudligidan saqlaning.
i.Nonspesifik kuchaytirishni oldini olish uchun primerning o'ziga xosligini tekshirish uchun NCBI BLAST funksiyasidan foydalaning.
