Proteinaz K NGS (chang)
Mushuk raqami: HC4507A
NGS Proteaz K - yuqori ferment faolligi va keng substrat o'ziga xosligi bilan barqaror serin proteaza. Ferment hidrofobik aminokislotalar, oltingugurt o'z ichiga olgan aminokislotalar va aromatik aminokislotalarning C-terminaliga ulashgan ester bog'lari va peptid bog'larini afzal ko'radi.Shunday qilib, u ko'pincha oqsillarni qisqa peptidlarga parchalash uchun ishlatiladi.NGS Proteaz K Asp bilan tipik serin proteazdir39-Uniki69-Ser224Serin proteazalariga xos bo'lgan katalitik triada va katalitik markaz tortma Ca bilan o'ralgan.2+kengroq sharoitlarda yuqori ferment faolligini saqlab turish uchun ulanish joylari.
Spetsifikatsiya
| Tashqi ko'rinish | Oqdan oq ranggacha amorf kukun, liyofillangan |
| Maxsus faoliyat | ≥40U/mg qattiq |
| DNase | Hech kim aniqlanmadi |
| RNase | Hech kim aniqlanmadi |
| Biologik yuk | ≤50CFU/g qattiq |
| Nuklein kislota qoldig'i | <5pg/mg qattiq |
Xususiyatlari
| Manba | Tritirachium albomi |
| EC raqami | 3.4.21.64(Tritirachium albomidan rekombinant) |
| Molekulyar og'irlik | 29kDa (SDS-PAGE) |
| Izoelektrik nuqta | 7.81 1-rasm |
| Optimal pH | 7.0-12.0 (Hammasi yuqori faollikni bajaradi) 2-rasm |
| Optimal harorat | 65℃ 3-rasm |
| pH barqarorligi | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) 4-rasm |
| Termal barqarorlik | 50℃ dan past (pH 8.0, 30min) 5-rasm |
| Saqlash barqarorligi | 25℃ haroratda 12 oy saqlanadi.6-rasm |
| Aktivatorlar | SDS, karbamid |
| Inhibitorlar | diizopropil florofosfat;benzilsulfonil ftorid |
Saqlash shartlari
Liyofillangan kukunni yorug'likdan uzoq vaqt davomida -25 ~ -15 ℃ haroratda saqlang;Eritgandan so'ng, yorug'likdan 2-8 ℃ masofada qisqa muddatli saqlash uchun yoki yorug'likdan -25 ~ -15 ℃ uzoq muddatli saqlash uchun tegishli hajmga alikot bering.
Ehtiyot choralari
Foydalanish yoki tortish paytida himoya qo'lqop va ko'zoynak taqing va foydalanishdan keyin yaxshi havalandırılmalıdır.Ushbu mahsulot terining allergik reaktsiyasiga va ko'zning jiddiy tirnash xususiyati keltirib chiqarishi mumkin.Agar nafas olayotgan bo'lsa, u allergiya yoki astma belgilari yoki nafas qisilishiga olib kelishi mumkin.Nafas olishning tirnash xususiyati keltirib chiqarishi mumkin.
Birlik ta'rifi
NGS Proteaz K ning bir birligi standart aniqlash sharoitida kazeinni 1 mkmol L-tirozinga gidrolizlash uchun zarur bo'lgan ferment miqdori sifatida aniqlanadi.
Reaktivlarni tayyorlash
| Reaktiv | Ishlab chiqaruvchi | Katalog |
| Kazein texniksigir sutidan | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm kimyoviyReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4· 2H2O | Sinopharm kimyoviyReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm kimyoviyReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Trikloroatsetik kislota | Sinopharm kimyoviyReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Natriy asetat | Sinopharm kimyoviyReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Sirka kislotasi | Sinopharm kimyoviyReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm kimyoviyReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Natriy karbonat | Sinopharm kimyoviyReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Folin-fenol | Sangon Biotech (Shanxay)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirozin | Sigma | 93829 |
Reaktiv I:
Substrat: sigir suti eritmasidan 1% kazein: 1 g sigir suti kazeini 50 ml 0,1 M natriy fosfat eritmasida eritiladi, pH 8,0, suv hammomida 65-70 °C da 15 daqiqa davomida isitiladi, aralashtiriladi va eritiladi, suv bilan sovutiladi, sozlang natriy gidroksidi pH 8,0 gacha va 100 ml gacha suyultiriladi.
Reaktiv II:
TCA eritmasi: 0,1M trikloroatsetik kislota, 0,2M natriy asetat va 0,3M sirka kislotasi (1,64 g trikloroatsetat + 1,64 g natriy asetat + 1,724 ml sirka kislotasi og'irligi ketma-ketlikda, 50 ml deionizatsiyalangan suv qo'shing, pH 3 ga suyultiring va pH 0 ga sozlang. 100 ml).
Reaktiv III:
0,4 m natriy karbonat eritmasi (og'irligi 4,24 g suvsiz natriy karbonat va 100 ml suvda eritiladi)
IV reaktiv:
Folin fenol reaktivi: deionlangan suv bilan 5 marta suyultiriladi.
Reaktiv V:
Ferment erituvchisi: 0,1 M natriy fosfat eritmasi, pH 8,0.
Reaktiv VI:
L-tirozin standart eritmasi: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml L-tirozin 0,2M HCl bilan eritilgan.
Jarayon
1. UV-Vis spektrofotometrini yoqing va fotometrik o'lchovni tanlang.
2. To'lqin uzunligini 660nm qilib belgilang.
3. Suv hammomini yoqing, haroratni 37 ℃ ga qo'ying, haroratni 3-5 daqiqa davomida o'zgarmasligiga ishonch hosil qiling.
4. 0,5 ml substratni 2 ml santrifüj trubkasida 37 ℃ suv hammomida 10 daqiqa davomida oldindan qizdiring.
5. 0,5 ml suyultirilgan ferment eritmasini 10 daqiqa davomida oldindan qizdirilgan sentrifuga trubkasiga chiqarib oling.Ferment erituvchini bo'sh guruh sifatida belgilang.
6. Reaksiyadan so'ng darhol 1,0 ml TCA reaktivini qo'shing.Yaxshilab aralashtiring va suv hammomida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling.
7. Reaksiya eritmasini sentrifugalash.
8. Belgilangan tartibda quyidagi komponentlarni qo'shing.
| Reaktiv | Ovoz balandligi |
| Supernatant | 0,5 ml |
| 0,4 M natriy karbonat | 2,5 ml |
| Folin fenol reaktivi | 0,5 ml |
9. 37℃ dagi suv hammomida 30 daqiqa davomida inkubatsiya qilishdan oldin yaxshilab aralashtiriladi.
10. OD660OD deb belgilandi1;bo'sh nazorat guruhi: ODni aniqlash uchun ferment eritmasini almashtirish uchun ferment seyreltici ishlatiladi660OD sifatida2, DOD=OD1-OD2.
11. L-tirozin standart egri chizig'i: 0,5 ml turli konsentratsiyali L-tirozin eritmasi, 2,5 ml 0,4 M natriy karbonat, 5 ml santrifüj naychasida 0,5 ml Folin fenol reagenti, 37 ℃ da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling, OD uchun aniqlang.660L-tirozinning har xil konsentratsiyasi uchun Y=kX+b standart egri chizig'i olinadi, bu erda Y L-tirozin kontsentratsiyasi, X OD.600.
Hisoblash
2: Reaksiya eritmasining umumiy hajmi (ml)
0,5: ferment eritmasi hajmi (ml)
0,5: Xromogenni aniqlashda ishlatiladigan reaksiya suyuqligi hajmi (mL)
10: Reaktsiya vaqti (daq)
Df: Ko'p suyultirish
C: Ferment konsentratsiyasi (mg/ml)
Raqamlar
1-rasm DNK qoldig'i
| Namuna | Ave C4 | Nuklein kislotasi Qayta tiklash (pg/mg) | Qayta tiklash (%) | Jami nuklein kislota ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNKsiz H2O | Aniqlanmagan | — | — | — |
2-rasm Optimal pH
3-rasm Optimal harorat
4-rasm pH barqarorligi
5-rasm Termik barqarorlik
6-rasm 25℃ da saqlash barqarorligi
