Universal SYBR GREEN qPCR Premiksi (Moviy)
Mushuk raqami: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (bo'yoq asosidagi) yuqori sezuvchanlik va o'ziga xoslik bilan tavsiflangan, ko'k rangga ega va namunani qo'shishni kuzatish ta'siriga ega bo'lgan 2 × real vaqtda miqdoriy PCR kuchaytirish uchun oldindan yechimdir.Taq DNK polimerazasining asosiy komponenti namunani tayyorlash paytida primerning tavlanishi tufayli o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilishini samarali ravishda inhibe qilish uchun antikor issiq boshlanishidan foydalanadi.Shu bilan birga, formula PCR reaktsiyasini kuchaytirish samaradorligini oshirish va turli xil GC tarkibiga ega (30 ~ 70%) genlarning kuchayishini tenglashtirish uchun rag'batlantiruvchi omillarni qo'shadi, shuning uchun miqdoriy PCR keng miqdoriy ko'rsatkichlarda yaxshi chiziqli munosabatlarga ega bo'lishi mumkin. mintaqa.Ushbu mahsulotda ko'pchilik qPCR asboblari uchun qo'llaniladigan maxsus ROX Passive Reference Dye mavjud.Turli xil asboblarda ROX kontsentratsiyasini sozlash shart emas.Reaksiya tizimini kuchaytirish uchun tayyorlash uchun faqat primerlar va shablonlarni qo'shish kerak.
Komponentlar
Universal Blue qPCR Master Mix
Saqlash shartlari
Mahsulot muz paketlari bilan jo'natiladi va -25 ℃ ~ -15 ℃ haroratda 18 oy davomida saqlanishi mumkin.Reaksiya tizimini saqlash yoki tayyorlashda kuchli yorug'lik nurlanishidan qochish kerak.
Spetsifikatsiya
| Diqqat | 2× |
| Aniqlash usuli | SYBR |
| PCR usuli | qPCR |
| Polimeraza | Taq DNK polimeraza |
| Namuna turi | DNK |
| Amaliy uskunalar | Ko'pgina qPCR asboblari |
| Mahsulot turi | Haqiqiy vaqtda floresan miqdoriy PCR uchun SYBR premiksi |
| Murojaat qilish (ilova) | Gen ifodasi |
Ko'rsatmalar
1.Reaktsiya tizimi
| Komponentlar | Hajmi (mL） | Hajmi (mL） | Yakuniy konsentratsiya |
| Universal SYBR GREEN qPCR Premiksi | 25 | 10 | 1× |
| Oldinga astar (10mkmol/L) | 1 | 0.4 | 0,2 mkmol/l |
| Teskari astar (10mkmol/L) | 1 | 0.4 | 0,2 mkmol/l |
| DNK | X | X | |
| ddH2O | 50 gacha | 20 gacha | - |
[Eslatma]: Kuchli chayqalishdan ortiqcha pufakchalar paydo bo'lmasligi uchun ishlatishdan oldin yaxshilab aralashtiriladi.
a) Primer konsentratsiyasi: Yakuniy primer kontsentratsiyasi 0,2 mkmol/L ni tashkil qiladi va tegishlicha 0,1 dan 1,0 mkmol/L gacha sozlanishi mumkin.
b) Shablon konsentratsiyasi: Agar shablon suyultirilmagan cDNK eritmasi bo'lsa, ishlatiladigan hajm qPCR reaktsiyasining umumiy hajmining 1/10 qismidan oshmasligi kerak.
c) Shablonni suyultirish: cDNK eritmasini 5-10 marta suyultirish tavsiya etiladi.Qo'shilgan shablonning optimal miqdori kuchaytirish orqali olingan Ct qiymati 20-30 tsikl bo'lganda yaxshiroqdir.
d) Reaktsiya tizimi: Maqsadli gen kuchaytirilishining samaradorligi va takrorlanishini ta'minlash uchun 20 mkl yoki 50 mkl dan foydalanish tavsiya etiladi.
e) Tizimni tayyorlash: Iltimos, juda toza skameykada tayyorlang va nukleaza qoldig'isiz uchlari va reaktsiya naychalaridan foydalaning;uchlarini filtrli kartridjlar bilan ishlatish tavsiya etiladi.O'zaro kontaminatsiyadan va aerozol bilan ifloslanishdan saqlaning.
2.Reaktsiya dasturi
Standart dastur
| Velosiped bosqichi | Temp. | Vaqt | Velosipedlar |
| Dastlabki denaturatsiya | 95℃ | 2 min | 1 |
| Denaturatsiya | 95℃ | 10 sek | 40 |
| Yuvish/kengaytirish | 60℃ | 30 soniya★ | |
| Erish egri bosqichi | Asbobning standart sozlamalari | 1 | |
Tez dastur
| Velosiped bosqichi | Temp. | Vaqt | Velosipedlar |
| Dastlabki denaturatsiya | 95℃ | 30 sek | 1 |
| Denaturatsiya | 95℃ | 3 sek | 40 |
| Yuvish/kengaytirish | 60℃ | 20 soniya★ | |
| Erish egri bosqichi | Asbobning standart sozlamalari | 1 | |
[Izoh]: Tez dastur genlarning katta qismi uchun mos keladi va standart dasturlarni alohida murakkab ikkilamchi struktura genlari uchun sinab ko'rish mumkin.
a) Yuvish harorati va vaqti: Iltimos, primer va maqsadli gen uzunligiga qarab sozlang.
b) Floresan signalini olish (★): Iltimos, asbobdan foydalanish bo'yicha ko'rsatmalardagi talablarga muvofiq eksperimental protsedurani o'rnating.
c) Erish egri chizig'i: Asbobning standart dasturi odatdagidek ishlatilishi mumkin.
3. Natijalarni tahlil qilish
Miqdoriy tajribalar uchun kamida uchta biologik replikatsiya talab qilingan.Reaksiyadan so'ng kuchaytirish egri chizig'i va erish egri chizig'ini tasdiqlash kerak.
3.1 Kuchaytirish egri chizig'i:
Standart kuchaytirish egri chizig'i S shaklida.Miqdoriy tahlil Ct qiymati 20 dan 30 gacha tushganda eng aniq bo'ladi. Agar Ct qiymati 10 dan kam bo'lsa, shablonni suyultirish va sinovni qayta o'tkazish kerak.Ct qiymati 30-35 gacha bo'lganida, kuchaytirish samaradorligini oshirish va natijalarni tahlil qilishning aniqligini ta'minlash uchun shablon kontsentratsiyasini yoki reaktsiya tizimining hajmini oshirish kerak.Ct qiymati 35 dan katta bo'lsa, test natijalari genning ifodasini miqdoriy tahlil qila olmaydi, lekin sifatli tahlil uchun ishlatilishi mumkin.
3.2 Erish egri chizig'i:
Erish egri chizig'ining yagona tepaligi reaktsiyaning o'ziga xosligi yaxshi ekanligini va miqdoriy tahlilni amalga oshirish mumkinligini ko'rsatadi;agar erish egri chizig'i ikki yoki bir nechta tepaliklarni ko'rsatsa, miqdoriy tahlilni amalga oshirib bo'lmaydi.Erish chizig'i ikki tomonlama cho'qqilarni ko'rsatadi va maqsadli bo'lmagan tepalik primer dimermi yoki DNK agaroz gel elektroforezi bilan o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilishini hukm qilish kerak.Agar u primer dimer bo'lsa, primer konsentratsiyasini kamaytirish yoki yuqori kuchaytirish samaradorligi bilan primerlarni qayta loyihalash tavsiya etiladi.Agar bu o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish bo'lsa, iltimos, yumshatish haroratini oshiring yoki primerlarni o'ziga xoslik bilan qayta loyihalashtiring.
Eslatmalar
Iltimos, sog'ligingiz va xavfsizligingizni ta'minlash uchun kerakli shaxsiy himoya vositalarini, masalan, laboratoriya xalati va qo'lqoplarni kiying!
Ushbu mahsulot FAQAT tadqiqot uchun mo'ljallangan!
